肩袖損傷患者肌腱和骨組織中氧化應激狀態及Beclin1、mTOR的表達分析

劉治軍，劉少津，鄭維蓬，魏合偉*，廖志浩，陳勝

(1.廣州中醫藥大學第三附屬醫院運動醫學科，廣東 廣州 510240；2.廣東省中醫院運動醫學科，廣東 廣州 510115)

肩袖損傷是人體常見的運動系統疾病，可由外傷、退行性等因素導致。在美國，每年大約有450萬人因肩痛就診，其中約25萬人接受了肩袖手術的治療[1]。在中國，隨著人口老齡化趨勢和全民健身普及，肩袖損傷的發病率和就醫率也在逐步上升。氧化應激是機體促氧化與抗氧化失衡，產生自由基增多、組織器官抗氧化能力下降的一種病理狀態，它可導致創面損害，不利于愈合[2]。自噬是一種動態的分解代謝過程，與細胞損傷、修復、增殖等密切相關，在細胞應激和環境適應中起重要作用[3]。自噬在一定程度上具有抵抗細胞凋亡的作用，但是也并非都是積極保護作用，過度或不足的自噬都能損傷細胞，甚至可致細胞死亡[4]。在臨床中發現損傷后的肩袖往往無法自行愈合，甚至撕裂嚴重導致其他結構損傷。即使通過關節鏡手術治療，修復后的肩袖也往往因腱骨愈合不良容易再發撕裂。因此，本研究通過觀察肩袖損傷發生時肌腱和肩袖止點足印區骨組織中氧化應激反應及Beclin1、雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)差異表達情況，來探討氧化應激和自噬對腱-骨愈合的作用。

1 材料和方法

1.1 實驗材料 選擇2019年7月至2020年12月廣州中醫藥大學第三附屬醫院符合肩袖損傷診斷標準[5]的20例患者，男10例，女10例；年齡30～75歲，平均(61.52±7.32)歲。全部患者均行肩關節鏡下肩袖錨釘修補術，術中提取患者損傷的肌腱組織和肩袖止點足印區骨組織樣本為損傷組，取正常的肌腱組織和足印區旁骨組織樣本為對照組。獲得肌腱和骨組織樣本的方案已得到廣州中醫藥大學第三附屬醫院研究倫理委員會的批準(中國廣州)，并簽署知情同意書。本試驗研究經中國臨床試驗注冊中心注冊，注冊號為ChiCTR-2000033948。各組患者臨床特征之間沒有差異，包括年齡、體重指數、性別、糖尿病、高血壓和外周動脈疾病。所有處理過的肌腱和骨組織標本均使用液氮冷凍，保存備用。

TRIzol試劑(批號：DP424，北京天根生化)，0.25%胰蛋白酶(批號：15050065，Gibco)，Dulbecco氏培養基(Dulbecoo's modified eagle medium，DMEM)(批號：11965092，Gibco)，cDNA合成試劑盒(批號：KR118，北京天根生化)，逆轉錄聚合酶鏈式反應(reverse transcriotion-polymerase chain reaction，RT-PCR)試劑盒(批號：QP002，廣州復能基因)，組織活性氧(reactive oxygen species，ROS)檢測試劑盒(批號：BB-470532，貝博生物)，超氧化物檢測試劑盒(批號：S0060，碧云天)，Beclin-1(D40C5)Rabbit mAb(批號：3495T，CST)，mTOR(7C10)Rabbit mAb(批號：2983T，CST)，P-mTOR(Ser2448)(D9C2)Rabbit(批號：5536T，CST)，聚氰基丙烯酸正丁酯(butyleyanoacrylate，BCA)蛋白濃度測定試劑盒(批號：P0012，碧云天)，電化學發光(electro-chemi luminescence，ECL)液(批號：P0018S，碧云天)。離心機(型號：ST16，Thermo Fisher公司)，RT-PCR儀(型號：7500，ABI)，核酸微量分析儀，多功能酶標儀。

1.2 實驗方法

1.2.1 ROS檢測 從液氮中取出保存的各組肌腱和骨組織臨床標本，解凍后用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered solution，PBS)洗凈，準確稱取50 mg組織，加入1 mL勻漿緩沖液A，用玻璃勻漿器充分勻漿；1 000轉/min 4 ℃離心10 min，棄沉淀，取上清。采用ROS檢測試劑盒(貝博，BB-470532)檢測組織中ROS水平，用2'，7'-二氯二氫熒光素二乙酸酯(2'，7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate，DCFH-DA)法檢測肌腱和骨組織樣本中的總ROS水平。主要方法為：在96孔板中加入190 μL勻漿上清液、10 μL O12探針，用移液器吹打，使之重復混勻；在37 ℃避光孵育15～30 min；置于酶標儀中，后于激發波長為488 nm、發射波長526 nm檢測熒光強度；活性氧水平計算公式：相對熒光強度=(熒光強度樣品1-熒光強度空白對照)/(熒光強度樣品n-熒光強度空白對照)×100%。

1.2.2 組織超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)檢測 準確稱取50 mg組織，放進15 mL錐形離心管。加3 mL GENMED清理液(Reagent A)清洗1次。切碎組織，放進預冷的15 mL錐形離心管。加入250 μL預冷的GENMED裂解液(Reagent B)。震蕩5 s，充分混勻。放進預冷的dounce勻漿器。勻漿棒勻化組織，勻漿物移入1.5 mL離心管，移取10 μL進行蛋白定量檢測。另取10 μL上清勻漿液，用PBS大約稀釋5倍，取20 μL進行蛋白定量。采用組織超氧陰離子檢測試劑盒(GENME，GMS10096.2 v.A)，用二氫乙錠(dihydroethidium，DHE)法檢測SOD含量。按照說明檢測組織中超氧陰離子水平：96孔板每孔加入100 μL組織上清和100 μL超氧化物檢測工作液，37 ℃孵育3 min。加入可以誘導產生超氧化物的刺激物，如丙二酸甲醚醋酸酯等，刺激30 min。在450 nm測定吸光度。移取50 μL GENMED緩沖液(Reagent C)到空白對照孔，移取50 μL上述準備的待測樣品到待測樣品孔里。分別加入50μL GENMED染色液(Reagent D)。混勻，37 ℃培養箱里孵育30 min，離心，抽去上清液，分別加入100 μL GENMED溶解液(Reagent E)，混勻。孵育5 min，放進酶標儀里測讀：獲得吸光讀數(OD)。構建生成曲線：縱座標(Y軸)為吸光值(OD)；橫坐標(X軸)為組織量、時間點或藥物處理濃度等。計算樣本濃度：[(樣品讀數-背景讀數)×0.1 mL(體系容量)×樣品稀釋倍數]÷[0.05 mL(樣品容量)×20 μmol(吸光系數)× 0.6 cm(光徑距離)]=μmol/mL÷(樣品蛋白濃度) mg/mL=μmol/mg。

1.2.3 RT-PCR檢測Beclin1和mTOR mRNA的表達 取出液氮保存的各組臨床標本，解凍后用PBS洗凈。準確稱取50 mg組織，加入1 mL TRIzol，根據試劑盒說明書提取總RNA。于PCR儀上70℃保溫5 min，迅速置冰上冷卻。依次加入4 μL 5×buffer，2 μL 10 mmol脫氧核糖核苷三磷酸(deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP)，1 μL RNA inhibitor和1 μL 反轉錄酶，混勻。于PCR儀上42 ℃保溫30 min，結束后80 ℃保溫5 min滅活反轉錄酶，RT-PCR反應，10 μL體系，反應條件：95 ℃ 10 min，95 ℃ 10 s，55 ℃ 20 s GOTO 39(40個循環)，72 ℃ 35 s。循環結束后從55 ℃升高到95 ℃獲取熔解曲線。用其系統軟件進行實驗結果分析：2-ΔΔCt法A=Ct(目的基因，待測樣本)-Ct(內標基因，待測樣本)；B=Ct(目的基因，對照樣本)-Ct(內標基因，對照樣本)K=A-B；表達倍數=2-K。 各基因引物序列見表1。

表1 RT-PCR引物序列

1.2.4 免疫蛋白印跡(western blot，WB)檢測Beclin1、p-mTOR/mTOR蛋白 取出液氮保存的各組臨床標本，解凍，PBS洗凈。準確稱取100 mg組織，加入0.1 mL裂解液，勻漿。4 ℃，12 000 g離心5 min，收集上清，即為總蛋白溶液。用PBS完全溶解標準品，使終濃度為0.5 mg/mL。根據標準曲線計算出樣品蛋白濃度。上樣電泳，轉膜。室溫下用5%的脫脂牛奶[0.5% TBST(TBS+Tween)配]，封閉1 h；稀釋一抗[TBST溶解的5%脫脂牛奶，磷酸化蛋白使用TBST溶解的5%牛血清白蛋白(bovine albumin，BSA)]，4 ℃過夜；稀釋二抗(TBST溶解的5%脫脂牛奶)，室溫下孵育30 min后，用TBST洗3次，每次5 min。將A和B兩種試劑等體積混合，將膜蛋白面朝上與此混合液充分接觸，包好，暗匣中曝光。最后用顯影、定影試劑進行顯影和定影；根據不同的光強度調整曝光條件。將膠片進行掃描存檔，ImageJ軟件處理系統分析目標帶的光密度值。

2 實驗結果

2.1 肌腱和骨組織ROS水平比較 與對照組比較，損傷組的肌腱和骨組織中ROS水平顯著升高(P<0.05)。表明肩袖損傷時肌腱和骨組織中活性氧含量增加(見圖1)。

圖1 兩組肌腱和骨組織ROS水平比較

2.2 肌腱和骨組織SOD含量比較 與對照組比較，損傷組的肌腱組織中SOD水平顯著降低(P<0.05)，而足印區骨組織中SOD水平顯著升高(P<0.05)。表明肩袖損傷時肩袖組織中SOD含量降低，而骨組織中含量升高(見圖2)。

圖2 兩組肌腱和骨組織中SOD含量比較

2.3 肌腱和骨組織中Beclin1、mTOR mRNA水平比較 PT-PCR檢測肩袖損傷患者肌腱和骨組織中Beclin1、mTOR mRNA水平，與對照組比較，損傷組的肌腱和骨組織中Beclin1mRNA表達顯著升高(P<0.05)，mTOR mRNA表達顯著降低(P<0.05，見圖3)。

圖3 兩組肌腱和骨組織中Beclin1、mTOR mRNA水平比較

2.4 肌腱和骨組織中Beclin1、p-mTOR/mTOR蛋白水平比較 WB檢測肩袖損傷患者肌腱和骨組織中Beclin1、p-mTOR/mTOR蛋白水平，與對照組比較，損傷組的肌腱和骨組織中Beclin1蛋白表達顯著升高(P<0.05)，p-mTOR蛋白表達顯著降低(P<0.05)，mTOR蛋白表達升高不明顯(見圖4～5)。

圖4 兩組肌腱和骨組織中Beclin1、p-mTOR/mTOR蛋白水平

圖5 兩組肌腱和骨組織中Beclin1、p-mTOR/mTOR蛋白電泳圖

3 討 論

肩袖的肌肉在維持正常盂肱運動和穩定性中起著重要作用。岡上肌用于啟動外展，岡下肌和小圓肌負責外旋，而肩胛下肌是肩部的主要內旋肌[6-7]。肩袖撕裂代表了一種常見的肩部病變，是肩部疼痛、活動受限的常見原因，不同年齡段人群其臨床癥狀表現不一。通常情況下，肩袖撕裂在老年人中比在年輕患者中更常見，其具有慢性或急性-慢性病程，并且通常繼發于肌腱變性[8]。肌腱是將肌肉與骨骼連接起來的纖維結締組織，它們的主要功能是在運動過程中將力從相應的肌肉傳遞到骨骼，因此，它們經常承受機械載荷。過度使用造成的肌腱損傷會導致疼痛和運動障礙，并可能發展為骨關節炎和殘疾[9]。肩袖修復術是治療肩袖損傷常用的手段，能有效緩解肩部疼痛、活動受限，但術后康復時間較長、且肩袖發生再撕裂的概率很高，其主要原因在于術后肩袖止點處腱-骨愈合較差，難以恢復原有的組織學結構特性和生物力學性能[10-11]。因此，如何有效提高肩袖止點處的腱-骨愈合是解決此類問題的關鍵。

肩袖損傷是一種比較常見的肌腱病，也是一種慢性活動受限綜合征，其特征是與活動相關的疼痛、腫脹或功能障礙。過度使用或衰老導致的肌腱損傷是目前臨床治療上的巨大挑戰，因為受損肌腱組織的自我修復非常緩慢且不完全。肌腱分化的分子機制很大程度上是不確定的，從而阻礙了肌腱修復新療法的發展[11]。在生理條件下，機體不斷產生活性氧，機體的抗氧化系統不斷清除活性氧，處于動態平衡狀態，不會對機體造成傷害[12]。然而，當有害刺激發生時，會產生大量活性氧，而抗氧化系統去除這些活性氧的能力有限，最終導致氧化損傷[13]。眾所周知，機械性超負荷會在肌腱細胞中誘導細胞應激，例如氧化應激和內質網應激，從而導致肌腱炎和肌腱變性[14]。在肌腱的退行性改變過程中，線粒體的功能障礙將導致ROS的過度增加，而ROS的過度產生引起的氧化應激將在肌腱的退變過程中發揮至關重要的作用，造成持續的肌腱功能喪失[15]。自噬是一種自然的破壞性機制，可以使功能異常的細胞組分有序降解和再循環。自噬被各種內在和外在的細胞應激激活，例如饑餓、ROS積累和缺氧，并且在這些應激條件下維持細胞穩態方面起著至關重要的作用[16-17]。mTOR和Beclin1都有介導自噬發生的作用，是自噬調控的重要因子，并形成Beclin1-mTOR交互調控網絡，在Beclin1調節自噬的網絡功能中，與mTOR細胞信號傳導通道之間存在的相互反饋調控機制[18-20]。本研究檢測了在臨床中收集的正常肩袖和受損肩袖組織、足印區和非足印區骨組織中的ROS、SOD水平，發現受損肩袖組織中ROS水平升高、SOD降低，而足印區骨組織中ROS、SOD表達水平都升高，表明受損的肌腱和足印區壞死的骨組織受到有害刺激后，影響了ROS、SOD的含量，激發了氧化應激反應。進而檢測了Beclin1、mTOR的表達含量，發現受損肩袖組織和足印區骨組織中Beclin1表達含量較高，而mTOR表達含量較低，說明Beclin1在調節自噬過程中與mTOR細胞信號傳導之間存在相互反饋調控機制；也表明由于ROS、SOD的過度積累，在氧化應激的條件下，誘導細胞產生自噬促進腱-骨愈合，以免受氧化應激造成的損害。

綜上所述，損傷的肌腱和足印區壞死的骨組織受到有害刺激后，導致ROS、SOD過度積累的微環境使細胞遭受強烈的氧化應激。與此同時，出于維持細胞穩態的作用，在氧化應激的條件下，誘導細胞產生自噬促進腱-骨愈合，以免受氧化應激造成的損害。其氧化應激和自噬具體通過何種途徑、機制來影響腱-骨愈合，仍需要進一步深入探討。