神經絲蛋白輕鏈與癲癇相關研究進展*

王慧瑜 鹿樹軍 席婭琳 王美玲

癲癇是一種慢性嚴重的神經系統疾病，常反復發作。癲癇影響著所有年齡段的人群，并已成為影響全世界7 000 多萬患者的全球健康問題，尤其是難治性癲癇，給患者及其家庭、社會均帶來巨大負擔。該疾病的發生是由于大腦活動異常導致，神經元網絡之間的異常連接可能導致病理上的同步放電和隨后的反復發作[1]。目前，尚無特定的生物標志物預測。

生物標志物是一種客觀的檢測方法，可以作為人體健康狀況及觀察疾病的進展和預后的指標。近年來，關于神經絲蛋白（neurofilaments，NF）作為神經系統疾病生物標志物的研究越來越多[2]。神經絲蛋白輕鏈（neurofilament light chain，NfL）是中樞神經系統軸突損害的標志物之一。越來越多的證據顯示，腦脊液（CSF）和血液中的NfL 水平在多種神經系統退行性疾病中發生改變，并在疾病的發生發展中發揮作用，是一種潛在的輔助鑒別診斷和評估預后的生物標志物，但其與癲癇的關系還需要進一步探究[3-4]。因此，針對癲癇的早期診斷、治療監測及預后評估的生物標志物研究仍是一個重大的臨床挑戰。

1 癲癇

1.1 癲癇的發生機制 癲癇是一種慢性神經系統疾病，它是由于神經元異常過度或同步化放電導致反復癲癇發作[5]。已確定的病因包括急性腦損傷（如神經營養不良、中風、腦腫瘤或癲癇持續狀態）、基因突變、中樞神經系統感染、代謝紊亂和自身免疫狀況[6]。癲癇發生是指將非癲癇性大腦轉變為能產生自發、反復發作的大腦的過程。這一過程是由神經元網絡內興奮性和抑制性活動之間的不平衡造成的[7-8]，因此它可能以過度、超同步、振蕩的方式發揮作用，一旦持續，就會干擾正常的神經元和神經元網絡[9-10]。

1.2 癲癇致癇灶病理變化 顳葉癲癇（temporal lobe epilepsy，TLE）是成人最常見的癲癇類型，其中海馬硬化（hippocampal sclerosis，HS）是最常見的病理改變。海馬硬化的特點是海馬角（cornu ammonis，CA）中CA1、CA3 和CA4 亞區的錐體細胞選擇性死亡。齒狀回顆粒細胞（granule cell，GC）的死亡程度遠低于錐體細胞，但顯示出兩種不同的病理變化：其細胞體的遷移，稱為顆粒細胞分散（granule cell dispersion，GCD），以及其軸突的發芽，即苔蘚纖維發芽（mossy fiber sprouting，MFS）[11-13]。致癇性損傷后，會出現MFS 并形成新的突觸連接。出芽的苔蘚纖維（mossy fiber，MF）很可能與GC 的樹突棘形成突觸。GC 是齒狀回中的神經元細胞，它們的棘狀樹突穿過顆粒細胞層投射到分子層，并在分子層中延伸和分出分支。苔蘚細胞的丟失和MF 的發芽并不是簡單用一個周期性興奮網絡取代另一個，相反，它用一個局部單突觸的興奮性反饋電路取代了一個遠端分布的突觸性興奮性反饋電路[14-15]。有研究證明，在TLE 患者中，廣泛的MFS 進入顆粒細胞層和分子層與CA4 和CA3區域的MF 缺失相關。MFS 取決于海馬區選擇性神經元丟失的程度。在輕度海馬硬化伴輕度神經元死亡（Wyler 分級Ⅰ、Ⅱ級）的患者中，MF 通常沿其自然方式投射到CA4 和CA3 中，而很少有MF 發芽進入顆粒細胞層和分子層。相反，在嚴重的海馬硬化癥（Wyler Ⅲ、Ⅳ級）中，CA4 和CA3 區域中有大量的MF 發芽，這很可能是高度硬化癥患者發芽的MF 和顆粒細胞丟失的代償作用，并且與較長的癲癇病程有關。此外，MFS 與GCD 的程度也相關[12]。這些結果證實了MF 發芽的假設，即它們因海馬神經元細胞死亡而失去了CA4 和CA3 區域的靶細胞。另外，相關研究顯示，MFS 并不局限于齒狀回，而且可能在沒有靶神經元死亡的情況下發育。在大量TLE 患者中，HS 中的MFS 并不局限于顆粒細胞層和分子層，而是在CA2 區也有發現，在CA1 區的程度較低。以往認為，進入顆粒細胞層的經典的MFS 是由CA3和CA4 的靶神經元喪失引發的[12，16-17]。進入CA2 的MFS 可能被解釋為類似的方式，因為CA2 和顆粒細胞層的神經元比CA4、CA3 和CA1 的神經元顯示出更好的存活性。然而，除了發芽至CA2 的MF 外，CA1 區域也存在MFS，這是一個有明顯細胞死亡的區域。該研究也表示，根據HS 的新ILAE 類型[18]，在ILAE 2 型中，盡管保留CA3 和CA4 的神經元細胞，但仍有廣泛的MFS 進入顆粒細胞層、CA2 和CA1 區域。過去，TLE 中的MFS 被認為是由CA3和CA4 區域的靶神經元死亡觸發的，并被定向到存活的顆粒細胞。而現有研究表明，MFS 到CA2 甚至CA1 區域，這與局部細胞損失無關[11]。

2 神經絲蛋白

2.1 神經絲蛋白的結構與功能 NF 是神經元細胞骨架的重要組成部分，主要分布于神經元的有髓軸突中，呈直的平行排列，且長度較長（平均118 mm），而分布在神經元樹突和細胞核周中的NF 相對稀疏且彎曲[19-20]。根據NF 直徑（約10 nm），將其歸類為中間絲蛋白，介于肌動蛋白絲（6 nm）和肌球蛋白絲（15 nm）間。一個成熟神經系統中的NfL、神經絲中鏈（neurofilament medium chain，NfM）、神經絲重鏈（neurofilament heavy chain，NfH）、α-內聯蛋白和外周蛋白組成。NF 由分子量不同的5 個亞基組成，它們在細胞骨架中具有結構功能，與其他纖維建立交叉橋接[21-22]。其中一個分子量較小的亞基——NfL 可作為軸突損傷的生物學標記物。神經元軸突損傷后，CSF 及在各種急性和慢性神經疾病的血液中NfL 均會隨之升高，包括炎癥、神經退行性疾病及中風。隨著檢測技術的發展，測量血液中NfL 水平已成為可能。因此，NfL 可能是未來臨床實踐和研究中最方便、最有希望的生物標志物之一[23-24]。

NF 通過與細胞骨架的其他成分交叉橋接和互連形成細胞骨架的組裝和穩定性[25]。NF 通過維持軸突的大小、形狀和口徑來提供結構支持。此外，NF 構成了一個參與神經元分化、軸突生長和再生的動態網絡。在大的有髓軸突中，高密度的NF 促進徑向軸突生長。它們被認為對神經元軸突的徑向生長和穩定性至關重要，從而實現有效的高速神經傳導。在分子水平上，NF 有助于塑造細胞環境、定位細胞核并支持細胞器。一些報告表明，NF 可與其他蛋白質和細胞器相互作用，包括線粒體和微管[19-21]。NfL 是神經元軸突中肌球蛋白的主要配體之一[26]，NfL 與神經元軸突中的肌球蛋白Va（myosin Va，Myo Va）的N 端運動結構域結合，這對維持正常的Myo Va 水平、分布和運輸至關重要。同時，Myo Va 與NfL 的結合還調節軸突中囊泡細胞器的分布[27-28]。NfL 與線粒體結合，并可能調節其動力學，如引起周圍神經病變Charcot-Marie-Tooth 病的NfL 的基因突變會阻礙神經元線粒體的運動[29]。在編碼NF 的基因中發現的幾種突變可導致異常的神經絲聚集和積累，從而導致軸突功能障礙和神經退行性變。NfL 還參與細胞內信號傳導、神經調節和轉錄。值得注意的是，最近的證據表明，NF 亞單位的獨特組裝體也是突觸的組成部分。NfL 是突觸棘的關鍵組成部分，對維持突觸結構完整性和功能至關重要。NfL 對于維持N-甲基-D-天冬氨酸受體（N-methyl-D-aspartate receptor，NMDAR）的穩定性和免疫突觸的活性也至關重要[20，30]。

2.2 可溶性神經絲蛋白的檢測 在NF 亞基中，NfL 是最豐富的，并且可溶于CSF 和血液。NfL 已成為許多神經系統急慢性疾病的重要生物標志物，如多發性硬化、阿爾茨海默病、帕金森病和急性脊髓損傷[31]。在過去三十年中，靈敏免疫分析技術的發展取得了很大的進展，NF 的檢測技術逐步得到了改進，更具臨床應用價值[21]。第一代免疫印跡法是半定量的檢測方法，對血液中NfL 水平的檢測靈敏度有限[32]。第二代酶聯免疫吸附試驗（enzymelinked immunosorbent assay，ELISA）與第三代電化學發光免疫（electrochemiluminescence，ECL）兩項檢測技術雖可檢測出不同疾病患者血液中的NF 水平，但尚不能監測與疾病相關的微小變化[33-34]。第四代單分子免疫陣列檢測（single-molecule array，SiMoA），對于NfL 的定量，SiMoA 技術的靈敏度分別是ELISA 和ECL 檢測的126 倍和25 倍。該技術提高了分析敏感度，從而可以在疾病和生理條件下觀察到的濃度范圍內可靠地量化血液中的NfL 水平。這種尖端方法基于單分子陣列和同時計數單個捕獲微珠（直徑2.7 μm），該微珠攜帶夾心抗體復合物（兩種抗體和一種抗原）。分析敏感度比使用為CSF測量設計的ELISA 格式中使用相同抗體獲得的敏感度高出許多倍，并且能可靠測量年輕健康個體血液樣本中存在的低NfL 濃度[35]。因此可以監測正常老化或輕度損傷后發生的NfL 水平的變化。許多研究表明血清或血漿與中NfL 水平與CSF 中的水平呈正相關，證明了NfL 作為多種疾病的血液生物標志物的有效性[34，36]。因此允許從血液水平得出關于正在進行的神經軸突損傷程度的結論，而無需通過腰椎穿刺獲得CSF[35，37-38]。在正常條件下，NfL 從軸突以恒定的低水平釋放；然而，這個比率隨著年齡的增長而增加。在軸突損傷時，腦脊液中NfL 的濃度可以增加到其原始水平的40 倍[37，39]。因此，NfL水平增加可以作為軸突損傷程度和疾病嚴重程度的指標[21]。

3 NfL與癲癇

在癲癇發生過程中，細胞變化包括神經退行性變、軸突出芽、軸突和髓鞘損傷、樹突重塑、各種類型的膠質增生、炎性細胞侵襲、血腦屏障損傷、血管生成、細胞外基質成分的變化、物質（如鐵和鈣）的可能聚集[40]，這些病理變化形成了一個“細胞和分子生態系統”，在這個生態系統中，興奮性增加，最終引發癲癇發作，并可通過治療進行調節。致癇組織環境表達并分泌可作為不同癲癇適應證的生物標志物的分子，包括治療試驗，使用多種檢測方法，如血液和CSF 分析、腦組織分析（如皮質或海馬組織）、影像學或電生理學。重要的是，在每個階段，致癇過程和生物標志物的發現都可能受到遺傳組成、微生物群和暴露體的調節。在過去四年中，癲癇生物標志物研究的數量迅速增加[41]。軸突損傷的兩個最成熟的腦脊液生物標志物是磷酸化微管相關蛋白tau 蛋白和NfL[42]。有研究指出，當神經軸突損傷時，NfL 可能大量釋放到血液中[22]，因此代表了神經損傷的一個有前景的微創生物標志物。同時該研究也表明，癲癇持續狀態患者的血清NfL（serum NfL，sNfL）水平明顯高于耐藥性癲癇患者組（單次孤立癲癇發作后24 h 內采集血樣）和健康對照組，而耐藥性癲癇患者組和健康對照組之間的sNfL 水平沒有差異；且發現sNfL 和CSF NfL 水平之間存在高度相關性[22]。當分析sNfL 與治療結果的關系時，難治性癲癇持續狀態患者的sNfL 水平較高。以上結果支持只有重復癲癇發作活動才會導致神經元損傷的觀點，可通過sNfL 水平來衡量。在癲癇持續狀態中，血-腦屏障破壞可能導致腦脊液NfL 向血液的釋放增加，使得sNfL 在這種情況下成為有效的神經軸索損傷的生物標志物。

4 展望

癲癇是神經病學面臨的另一個重大挑戰，需要對癲癇及其生物標志物進行積極探索。NfL 可能是未來關于癲癇，尤其是難治性癲癇，早期識別、診斷及治療結果研究中最方便、最有希望的生物標志物之一。此外，作為神經系統變性疾病敏感的生物學指標之一，NfL 的臨界值仍需進一步明確，且神經元受損后釋放NfL 的具體過程目前尚未完全闡明，同時關于釋放NfL 的具體始動因素、關鍵調控靶點的相關研究也相對較少。因此，未來仍需進一步明確NfL 在癲癇疾病中的具體作用及機制，為該疾病的早期診斷、治療及新藥物的研發提供依據。