維格列汀原料藥含量測(cè)定方法的研究

王麗霞，王宇棟，王鵬，劉新元，梁丙辰

（1.河北合佳醫(yī)藥科技集團(tuán)股份有限公司，河北 石家莊 052165；2.河北合佳醫(yī)藥科技集團(tuán)合佳研究院，河北 石家莊 050035）

0 引言

糖尿病是由于胰島素分泌及作用缺陷引起的以血糖升高為特征的慢性代謝疾病，口服的降糖藥包括胰島素增敏劑（噻唑烷二酮類和雙胍類）、胰島素分泌促進(jìn)劑（非磺酰脲類、磺酰脲類胰島素分泌促進(jìn)劑） 和α-葡萄糖苷酶抑制劑等。近年來(lái)，噻唑烷二酮類藥物的幾個(gè)品種包括曲格列酮、羅格列酮、吡格列酮等在臨床應(yīng)用過(guò)程中發(fā)現(xiàn)了肝損傷、心血管風(fēng)險(xiǎn)及誘發(fā)癌癥風(fēng)險(xiǎn)等毒副作用，限制了這類藥物的應(yīng)用。新型降糖藥二肽基肽酶-4 抑制劑類藥物具有較好的安全性和耐用性，為糖尿病患者提供了一種新的用藥選擇，顯示了良好的應(yīng)用前景。

維格列汀是一種高效的選擇性的Ⅳ型二肽基肽酶（DPP-4） 抑制劑，通過(guò)與DPP-4 結(jié)合形成DPP-4 復(fù)合物而抑制該酶的活性，在提高胰島高血糖樣多肽（GLP）-1 濃度、促使胰島B 細(xì)胞產(chǎn)生胰島素的同時(shí)，可降低胰高血糖素濃度，從而降低血糖，且對(duì)體重?zé)o明顯影響。不會(huì)出現(xiàn)傳統(tǒng)抗糖藥的體重增加，胃腸道不適，低血糖等副作用。與傳統(tǒng)抗糖藥相比有巨大優(yōu)勢(shì)，故有廣闊市場(chǎng)前景。

維格列?。╒ildagliptin），化學(xué)名（S）-1-[2-(3-羥基金剛烷-1-氨基)乙酰基]吡咯烷-2-腈，分子式為C17H25N3O2，相對(duì)分子質(zhì)量為303.40。根據(jù)維格列汀原料藥的合成工藝，可能存在較多雜質(zhì)等，為了保證藥品的安全性，現(xiàn)對(duì)自制的維格列汀原料藥進(jìn)行含量測(cè)定方法的研究，建立了高效液相色譜法（HPLC），方法簡(jiǎn)便、專屬性強(qiáng)、重復(fù)性及耐用性良好。

本文針對(duì)自制的維格列汀原料藥，對(duì)其主成分的含量進(jìn)行了質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立，以控制藥品質(zhì)量。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1 儀器與試劑

1.1 儀器

e2695 高效液相色譜儀，美國(guó)Waters 公司。

ME155DU電子天平，METTLER TOLEDO公司。

Five EasyPluspH 計(jì)，METTLER TOLEDO公司。

1.2 試劑

維格列汀原料藥（由河北合佳醫(yī)藥科技集團(tuán)合佳研究院自制，批號(hào)202104001、202105002、202106001、202107003）；維格列汀對(duì)照品（由原料藥精制而得，經(jīng)紅外、紫外、質(zhì)譜、核磁共振分析確證，批號(hào)202107001，HPLC 純度為99.7%）；原料、雜質(zhì)1、雜質(zhì)2（均由合成室自制，HPLC純度分別為97%、95%、99%）；乙腈為色譜純；其余試劑均為分析純；試驗(yàn)用水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：伊利特Hypersil ODS2 （4.6×250 mm，5μm）；流動(dòng)相：乙腈：0.01 MKH2PO4（K2HPO4調(diào)節(jié)pH 至6.5±0.05） =30 ∶70；稀釋劑為0.2%（v/v） 鹽酸溶液-乙腈（90∶10），流速為1.0 mL/min，溫度為35 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm，進(jìn)樣量為10 μL，檢測(cè)時(shí)間為15 min。

2.2 溶液配制

2.2.1 對(duì)照品溶液

取維格列汀對(duì)照品（批號(hào)為202107001） 25 mg，精密稱定，置于50 mL 容量瓶中，加入稀釋劑溶解并稀釋，制成1 mL約含維格列汀0.5 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。維格列汀結(jié)構(gòu)圖如圖1所示。

圖1 維格列汀結(jié)構(gòu)圖Fig.1 Structure of vildagliptin

2.2.2 供試品溶液

取維格列汀供試品（批號(hào)為202104001） 25 mg，精密稱定，置于50 mL 容量瓶中，加入稀釋劑溶解并稀釋，制成1 mL 約含維格列汀0.5 mg 的溶液，作為供試品溶液。

2.2.3 系統(tǒng)適應(yīng)性溶液

取維格列汀供試品、原料、雜質(zhì)1 和雜質(zhì)2 各適量，置于10 mL 容量瓶中，加入稀釋劑溶解并稀釋，作為系統(tǒng)適應(yīng)性溶液。

2.3 系統(tǒng)適用性及專屬性試驗(yàn)

取稀釋劑、對(duì)照品溶液和系統(tǒng)適應(yīng)性溶液，分別采用高效液相色譜儀分析，記錄色譜圖，對(duì)照品溶液高效液相色譜圖如圖2所示。

圖2 對(duì)照品溶液高效液相色譜圖Fig.2 High High performance liquid chromatography of reference solution

系統(tǒng)適應(yīng)性溶液高效液相色譜圖如圖3所示。

圖3 系統(tǒng)適應(yīng)性溶液高效液相色譜圖Fig.3 High performance liquid chromatography of system adaptation solution

由圖2和圖3可以看出，稀釋劑不干擾維格列汀主峰的測(cè)定，維格列汀主峰與原料及主要雜質(zhì)也能達(dá)到基線分離。理論塔板數(shù)按維格列汀主峰計(jì)算為9 820，各相鄰峰之間的分離度均＞1.5。

2.4 精密度試驗(yàn)

取“2.2”項(xiàng)下維格列汀對(duì)照品溶液10 μL，注入液相色譜儀，連續(xù)進(jìn)樣6 次測(cè)定，色譜峰面積的RSD 為0.47%。結(jié)果表明，方法的進(jìn)樣精密度良好。

2.5 檢測(cè)限與定量限

取“2.2”項(xiàng)下維格列汀對(duì)照品溶液適量，進(jìn)行逐級(jí)稀釋后，精密量取10 μL 注入液相色譜儀，經(jīng)分析，維格列汀的定量限為25 ng（S/N≈10）、檢測(cè)限為8.3 ng（S/N≈3）。且定量限連續(xù)進(jìn)樣6針的峰面積的RSD 值為2.04%。

2.6 線性實(shí)驗(yàn)

精密稱取維格列汀對(duì)照品250 mg 到50 mL 容量瓶中，得到儲(chǔ)備液a，分別量取0.7、0.8、0.9、1.0、1.1 和1.2 mL 置于10 mL 容量瓶中，用稀釋劑稀釋至刻度，搖勻，分別取10 μL 注入液相色譜儀，記錄色譜圖，以濃度（μg/mL） 對(duì)峰面積繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)等結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)等結(jié)果Table 1 Summary of linear data

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取“2.2”項(xiàng)下供試品溶液于室溫放置，并于0、2、4、8、12 和24 h 后測(cè)定，結(jié)果峰面積的含量在24 h 內(nèi)均無(wú)明顯變化（RSD 值≤2.0%），表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8 回收率試驗(yàn)

按“2.6”項(xiàng)下方法繪制工作曲線。精密量取20、25 和30 mg 各3 份分別置于50 mL 容量瓶中，配制成質(zhì)量濃度分別為0.4、0.5 和0.6 mg/mL 的供試溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，以工作曲線折算實(shí)際測(cè)量值，進(jìn)而計(jì)算各樣品回收率。各濃度下平均回收率均在98%～102%之間，RSD 均＜2.0%。表明回收率良好?；厥章蕯?shù)據(jù)匯總見(jiàn)表2。

表2 回收率數(shù)據(jù)匯總Table 2 Summary of recovery data

2.9 重復(fù)性試驗(yàn)

取批號(hào)為202104001 的維格列汀6 份，精密稱定，加稀釋劑溶解，分別取10 μL 注入液相色譜儀，記錄色譜圖，計(jì)算樣品含量的RSD=1.75%，表明方法的重復(fù)性良好。

2.10 樣品測(cè)試

取維格列汀3 批原料適量，按“2.1”項(xiàng)下所述方法進(jìn)行含量測(cè)試，樣品測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 樣品測(cè)定結(jié)果Table 3 Results in detection of samples

3 討論

3.1 色譜條件的優(yōu)化

由于維格列汀為弱堿性物質(zhì)，若流動(dòng)相為酸性或中性溶液，則其在C18 色譜柱上不易洗脫或峰形嚴(yán)重拖尾。故采用磷酸二氫鉀緩沖鹽并使用磷酸氫二鉀調(diào)節(jié)pH 至中性偏酸（6.5±0.05） 作為流動(dòng)相，可使物質(zhì)以陽(yáng)離子的形式存在，同時(shí)保證主峰的保留時(shí)間、改善拖尾情況。

3.2 樣品濃度的選擇

通過(guò)進(jìn)行不同濃度樣品的高效液相色譜測(cè)試，發(fā)現(xiàn)樣品濃度對(duì)分離及峰形影響較大。結(jié)果表明，維格列汀濃度較小時(shí)，樣品分離情況較好，且半峰寬也較小。在滿足檢測(cè)靈敏度的前提下，選擇較低的濃度對(duì)分離有利，因此確定樣品質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL。

3.3 耐用性考察

根據(jù)以上色譜條件，分別考察了不同品牌色譜柱[Welch Ultimate XB-C18 (4.6 ×250，5 μm)、Waters XBridge C18(4.6×250 mm，5 μm)]、流速（0.95、1.05 mL/min）、柱溫（33、37 ℃）、以及流動(dòng)相比例（27∶73、33∶67）。結(jié)果表明，上述條件下各組分均能得到較好的分離，該方法耐用性較好。

4 結(jié)語(yǔ)

通過(guò)HPLC 法測(cè)定維格列汀主成分的含量，結(jié)果顯示，此高效液相色譜法采用等度洗脫的洗脫方法，主峰與主要雜質(zhì)可實(shí)現(xiàn)完全分離、專屬性強(qiáng)、靈敏度高、簡(jiǎn)化分析步驟、大大縮短分析時(shí)間，可作為維格列汀含量檢測(cè)的方法。