冠突散囊菌LJSC.2005對茯茶主體黑毛茶發(fā)花品質影響

湯依鈺，俞夢瑤，禹利君,2,3,4*，黃建安,2,3,4，王坤波,2,3,4，劉仲華,2,3,4*

1. 茶學教育部重點實驗室，湖南 長沙 410128；2. 國家植物功能成分利用工程技術研究中心，湖南 長沙 410128；3. 植物功能成分利用省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，湖南 長沙 410128；4. 農業(yè)農村部園藝作物基因資源評價利用重點實驗室，湖南 長沙 410128

茯茶是黑茶中深受消費者喜愛的茶類，主產于湖南安化，以櫧葉齊、云臺大葉、桃源大葉等品種制成的黑毛茶作為主要加工原料，具有獨特的風味。冠突散囊菌（Eurotium cristatum）在茯茶發(fā)花過程中的酶促氧化作用，是形成茯茶獨特的滋味成分及菌花香特征的關鍵[1]。研究發(fā)現(xiàn)，茯茶具有降脂減肥[2]、抗癌細胞增殖[3]、抗菌消炎[4]、改善吸煙造成的肺損傷[5]等諸多功效。發(fā)花散茶兼顧傳統(tǒng)茯茶功效的同時，還具有沖泡方便、“金花”（冠突散囊菌孢子囊）茂盛、菌香明顯等特點。通過使用冠突散囊菌單一菌種進行散茶發(fā)花，得到的發(fā)花散茶品質穩(wěn)定、安全。

香氣是茶葉品質判別的重要指標。氣相色譜-質譜聯(lián)用技術（GC-MS）精確性好、靈敏度高，已成為分析茶葉香氣品質的重要方法。Shi等[6]運用 GC-MS檢測到茯磚茶的主要香氣成分包括酮類、醛類、酯類等。頂空固相微萃取法（HS-SPME）作為茶葉香氣收集的方法之一，可以有效防止檢測過程中香氣成分的降解、氧化及組分間二次反應[7]，是 GC-MS前處理的優(yōu)選方法。茯茶發(fā)花期間香氣組成變化已有一些研究報道[8-10]，但研究選擇的多為傳統(tǒng)工藝發(fā)花的茯磚茶成品，發(fā)花環(huán)境因素復雜。本研究收集了湖南具有代表性的黑毛茶，并對其工藝特點進行總結考究，通過提取純化的冠突散囊菌LJSC.2005（GenBank accession numbers: MZ147024）進行散茶發(fā)花，將發(fā)花前后的茶樣進行感官審評、茶葉生化成分檢測和 HP-SPME/GC-MS香氣分析，探究冠突散囊菌 LJSC.2005參與不同湖南茯茶主體黑毛茶發(fā)花前后的滋味品質及香氣成分變化，為湖南茯茶品質提升提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

黑毛茶由湖南代表性茶廠提供（編號1、3、5、7、9、11），其對應發(fā)花散茶（編號2、4、6、8、10、12）參考 Xu等[11]方法，以冠突散囊菌LJSC.2005為單一菌種發(fā)花所得，試驗在湖南農業(yè)大學茶學教育部重點實驗室完成。部分毛茶經歷了七星灶熏煙、去梗工序，具體信息詳見表1。

表1 茶樣信息Table 1 The information of tea samples

1.2 試驗儀器

UV-1750型紫外可見分光光度計、LC-M20A型分析型高效液相色譜、GC/MS-QP2010型氣相色譜質譜聯(lián)用儀，日本島津公司；手動SPME進樣器、PDMS/DVB固相微萃取頭，美國Supelco公司。

1.3 試驗試劑

甲醇（HPLC級）、乙腈（HPLC級）購自美國TEDIA公司；沒食子酸、茶堿、可可堿和兒茶素標準品購自美國Sigma有限公司；槲皮素、楊梅素和山奈酚標準品（純度≥98%）購自成都曼斯特生物科技有限公司；碳酸鈉、福林酚、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、茚三酮、氯化鋁、蒽酮、濃硫酸均為國產分析純。

1.4 感官審評

參考 GB/T 23776—2018《茶葉感官審評方法》中黑茶散茶的審評方法，將12個茶樣分為黑毛茶和發(fā)花散茶2組進行密碼審評。審評小組由具有長期茶葉審評經驗的 3名教授及2名碩士研究生組成。按照外形、湯色、香氣、滋味、葉底的順序，逐項對茶樣進行百分制審評打分，并對結果進行加權計算得到總分。

1.5 生化成分檢測

茶多酚含量測定采用福林酚比色法，參照GB/T 8313—2018《茶葉中茶多酚和兒茶素類含量的檢測方法》；水浸出物含量測定參照GB/T 8305—2013《茶 水浸出物測定》；游離氨基酸含量測定采用茚三酮比色法，參照GB/T 8314—2013《茶 游離氨基酸總量的測定》；黃酮類化合物總量的測定采用三氯化鋁比色法，可溶性糖含量測定采用蒽酮比色法。

兒茶素、生物堿檢測方法參照Samanidou等[12]方法，試液制備浸提方法參考GB/T 8313—2018《茶葉中茶多酚和兒茶素類含量的檢測方法》，浸提液經 0.45 μm 纖維膜過濾。色譜柱為 Welchrom C18柱（4.6 mm×200 mm，5 μm），流動相A為0.2%磷酸，流動相B為V甲醇∶V乙腈=95∶5，梯度洗脫，流速0.8 mL·min-1，柱溫30℃，進樣量10 μL，檢測波長278 nm。

黃酮醇類物質檢測參照劉雁等[13]方法，試液制備參考張紀偉等[14]方法，色譜柱為Welchrom C18柱（4.6 mm×200 mm，5 μm），流動相A為0.2%磷酸，流動相B為100%甲醇，梯度洗脫，流速1 mL·min-1，柱溫30℃，進樣量10 μL，檢測波長為360 nm。

1.6 GC-MS檢測分析

稱取2.0 g磨碎茶樣于20 mL萃取瓶，80℃水浴平衡 10 min，萃取頭 210℃老化 50 min，吸附50 min，250℃解吸附5 min。

GC條件：HP-88石英毛細管柱（100 m×0.25 mm×0.20 μm），進樣口溫度 240℃，流速1.37 mL·min-1。升溫程序：初始溫度60℃保持5 min；以3℃·min-1升至140℃，保持5 min；以 5℃·min-1升至 210℃，保持 10 min；以5℃·min-1升至 240℃，保持 10 min。進樣方式為不分流進樣，載氣為He。

MS條件：離子源（EI），離子源溫度200℃，轉接口溫度220℃，電子能量70 eV，質量掃描范圍為45～500m/z。

1.7 數據整理

采用 SIMCA-P 14.1軟件、IBM SPSS Statistics 19軟件、WPS 2019教育版、聯(lián)川生物云平臺（www.omicstudio.cn/tool）進行數據統(tǒng)計和圖表制作。根據GC-MS分析得到各色譜峰的質譜信息，參考NIST17標準譜庫，結合文獻篩選相似度大于 80%的揮發(fā)性成分進行定性分析；根據香氣成分的峰面積采用峰面積歸一法得到各個香氣成分的相對含量。

2 結果與分析

2.1 黑毛茶及發(fā)花散茶感官審評結果分析

發(fā)花前后茶樣感官品質有明顯改變（表2）。發(fā)花后，干茶色澤加深，茶條平伏卷緊，金花滿披、顆粒顏色亮黃，油潤發(fā)亮有光澤；氣味純正無異味，香氣更加濃郁，菌花香顯露；茶湯清澈明亮，顏色變紅、加深；滋味更加醇和厚重；葉底顏色加深，葉片、嫩梗變軟。冠突散囊菌 LJSC.2005發(fā)花能夠明顯降低黑毛茶過重煙熏味，減輕茶樣青氣及澀味，使得茶樣茶香、菌香、松煙香調和，整體評分上升。黑毛茶初制工藝影響冠突散囊菌 LJSC.2005發(fā)花品質，主要表現(xiàn)在缺少煙熏且同時伴有剔梗的桃源大葉A發(fā)花過度、略帶酸味。

表2 黑毛茶及發(fā)花散茶感官審評結果Table 2Sensory evaluation results of the primarydarktea andloose tea fermentedbyE. cristatumLJSC.2005

2.2 黑毛茶及發(fā)花散茶生化成分分析

主要內含成分檢測結果表明（表3），黑毛茶經冠突散囊菌LJSC.2005發(fā)花后，發(fā)花散茶中黃酮類、茶多酚和游離氨基酸含量下降，水浸出物和可溶性糖含量總體呈下降趨勢。黃酮類、茶多酚和游離氨基酸含量降幅最大的茶樣分別為云臺大葉B、櫧葉齊B和云臺大葉B，分別為33.87%、39.62%和47.74%。安化云臺山八角茶葉有限公司和湖南省云上茶業(yè)有限公司朱沖茶廠的黑毛茶經發(fā)花后水浸出物含量有所下降，其中云臺大葉 A降幅最大，為9.69%，其余茶樣則有不同幅度的上升，其中櫧葉齊B增幅最大，達9.71%?？扇苄蕴呛拷Y果顯示，僅有湖南省白沙溪茶廠股份有限公司的黑毛茶發(fā)花后有所上升，其中櫧葉齊 B增幅較大，達 42.38%，而其余黑毛茶茶樣發(fā)花后可溶性糖含量下降，桃源大葉 A降幅達28.42%。

表3 黑毛茶及發(fā)花散茶主要內含成分含量Table 3The main contents of the primarydarktea andloose tea fermentedbyE. cristatum LJSC.2005%

HPLC對兒茶素、生物堿和黃酮醇類物質的生化檢測結果顯示（表4），黑毛茶經冠突散囊菌LJSC.2005發(fā)花后，發(fā)花散茶沒食子酸和咖啡堿呈上升趨勢，可可堿變化不明顯，兒茶素、楊梅素、槲皮素和山奈酚呈下降趨勢。沒食子酸僅有櫧葉齊 B發(fā)花后含量下降，降幅19.07%，云臺大葉B發(fā)花后沒食子酸含量增幅最大，達440.46%?？煽蓧A含量結果中，安化云臺山八角茶葉有限公司和湖南省云上茶業(yè)有限公司朱沖茶廠的黑毛茶發(fā)花后含量下降，其中云臺大葉A降幅最大，達60.00%，其余茶樣中桃源大葉A可可堿含量增幅最大，為19.57%。云臺大葉品種發(fā)花后咖啡堿含量下降，其中云臺大葉A降幅較大，為16.10%；桃源大葉B發(fā)花后咖啡堿含量增幅最大，為16.86%。各茶樣中的兒茶素含量在發(fā)花后基本呈下降趨勢，EG和DL-C含量降幅最大的分別為云臺大葉A（50.75%）和云臺大葉B（34.23%）；EGCG、EC、GCG、ECG含量降幅最大的均為櫧葉齊A，分別為 96.46%、53.70%、92.46%、96.14%；櫧葉齊A、云臺大葉A和桃源大葉B發(fā)花后DL-C含量上升，云臺大葉A增幅最大（262.10%）。各茶樣中楊梅素、槲皮素和山奈酚含量在發(fā)花后大多呈下降趨勢，降幅最大的分別為云臺大葉B（64.55%）、云臺大葉B（64.52%）、桃源大葉B（25.83%）。

表4 黑毛茶及發(fā)花散茶生化成分含量Table 4Biochemical component contents of the primarydarktea andloose tea fermentedbyE. cristatum LJSC.2005 mg·g-1

2.3 黑毛茶及發(fā)花散茶香氣組成和相對成分分析

所有茶樣共檢測到71種香氣成分（表5），其中碳氫化合物14種，醇類16種，醛類10種，酯類6種，酚類4種，內酯類1種，含氮化合物6種，含氧化合物4種，含量較多的為碳氫化合物（22.85%）、醇類（20.78%）、酮類（12.49%）、醛類（12.49%）。在黑毛茶中檢測到香氣成分 55種，特有香氣成分 8種；在發(fā)花散茶中檢測到香氣成分63種，特有香氣成分16種，兩者共有香氣成分47種（圖1-A）。12個茶樣都含有的香氣成分共 12種（圖1-C），除了櫧葉齊B之外，所有茶樣發(fā)花后香氣成分種類增多（圖1-B）。苯乙烯和異丁酸葉醇酯為黑毛茶共有香氣成分；(E)-芳樟醇3,7-氧化物、異植物醇和苯乙酮為發(fā)花散茶共有香氣成分（圖1）。黑毛茶經冠突散囊菌LJSC.2005發(fā)花后，所有茶樣醛類和酯類香氣成分含量上升，安化云臺山八角茶葉有限公司和湖南省云上茶業(yè)有限公司朱沖茶廠的茶樣出現(xiàn)含氧化合物，其他種類香氣成分基本呈下降趨勢（圖2）。

表5 黑毛茶及發(fā)花散茶主要香氣成分和相對含量Table 5 Main aroma components and their relative contents in the primary dark tea and loose tea fermented by E. cristatum LJSC.2005%

續(xù)表5

圖1 黑毛茶及發(fā)花散茶共有及特有香氣成分數量Fig. 1 Quantity of common and unique aroma components of the primary dark tea and loose tea fermented by E. cristatum LJSC.2005

圖2 黑毛茶及發(fā)花散茶香氣成分組成Fig. 2 Composition of aroma components of the primary dark tea and loose tea fermented by E. cristatum LJSC.2005

2.4 黑毛茶及發(fā)花散茶特征香氣成分分析

在SIMCA軟件中對茶樣香氣成分相對含量進行主成分分析（PCA），所構成的模型中R2X=0.451，Q2=0.126，模型質量較好，分析結果所作Biplot圖中（圖3-A），同一坐標軸上同方向的樣品和香氣成分呈正相關。PCA結果表明，發(fā)花前后茶樣區(qū)別明顯且發(fā)花后香氣近似。根據是否發(fā)花將所有茶樣分為黑毛茶和發(fā)花散茶兩組，構建OPLS-DA模型進行兩兩比較，擬合參數R2X=0.496，R2Y=0.99，Q2=0.931，說明該模型具有較好區(qū)分能力和預測能力，并作Biplot圖（圖3-B）、permutation圖（圖3-C）（n=200）和S-plot圖（圖3-D）。VIP predictive共篩選出 20種差異香氣成分（VIP值≥1），t檢測（Students’t-test）中P值≥0.05的香氣成分共4種，分別為(E,E)-2,4-

庚二烯醛、正十二烷、雪松醇、香葉基丙酮；P值≤0.05的香氣成分共16種，分別為水楊酸甲酯、(E)-氧化芳樟醇（呋喃類）、正十三烷、(E)-芳樟醇3,7-氧化物、苯甲醇、苯乙醇、苯乙烯、橙花醇、(E)-2-已烯醛、(E)-橙花叔醇、正十四烷、苯乙酮、(E)-2-辛烯醛、β-紫羅蘭酮、異丁酸葉醇酯、6-甲基-3,5-庚二烯-2-酮，為檢測得到的湖南黑毛茶經冠突散囊菌LJSC.2005發(fā)花前后差異性香氣成分。

圖3 黑毛茶及發(fā)花散茶香氣成分SIMCA分析結果Fig. 3 SIMCA analysis of the primary dark tea and loose tea fermented by E. cristatum LJSC.2005

3 討論與結論

結合感官審評與生化成分檢測結果發(fā)現(xiàn)，采用冠突散囊菌 LJSC.2005對湖南茯茶主體黑毛茶進行發(fā)花后，發(fā)花散茶的茶湯呈現(xiàn)出更加醇和的口感，黃酮類、茶多酚和游離氨基酸呈下降趨勢，特別是酯型兒茶素中的 EGCG降幅顯著，可能是茶湯苦澀味消失的主要原因。發(fā)花散茶可溶性糖含量變化中，僅湖南省白沙溪茶廠股份有限公司茶樣的含量上升；水浸出物含量變化中，僅桃源縣君和野茶開發(fā)有限公司與湖南省白沙溪茶廠股份有限公司茶樣的含量有所上升，與傳統(tǒng)茯磚茶發(fā)花變化存在差異[15]。大部分茶樣發(fā)花后沒食子酸含量上升，兒茶素、楊梅素、槲皮素和山奈酚等黃酮類化合物呈下降趨。茶葉中的可可堿和咖啡堿，性質穩(wěn)定、微生物利用度低，在茯茶加工過程中一般呈緩慢下降趨勢[15]，但本研究中，部分茶樣發(fā)花后可可堿和咖啡堿含量有所上升，推測是品種和工藝多因素導致的結果。

碳氫化合物中對茯磚茶香氣有較大貢獻的一般為烯烴類[9]，如差異性成分苯乙烯具輕微甜味。本研究發(fā)現(xiàn)，黑毛茶發(fā)花后，醇類中具有花香和木香的(E)-氧化芳樟醇（呋喃類）相對含量上升，可能源于真菌對芳樟醇的轉化[16]，(E)-芳樟醇 3,7-氧化物為醇類香氣物質前體，最早在烏龍茶中[17]被提取得到；苯甲醇和苯乙醇分別具有果香和甜花香，發(fā)花后相對含量下降；具有花果香和木香的橙花醇和(E)-橙花叔醇等萜醇類化合物發(fā)花后也有不同程度的下降，與傳統(tǒng)茯磚茶發(fā)花過程中物質的變化趨勢相同[18]。酮類中的β-紫羅蘭酮具有紫羅蘭香，為茯磚茶菌花香重要貢獻物質，6-甲基-3,5-庚二烯-2-酮略帶刺激性肉桂香，兩者在發(fā)花后含量皆下降；苯乙酮具有花香，與“菌花香”“薄荷”等氣味正相關，在發(fā)花后含量上升，以上結果與Li等[18]研究結果相似。醛類中，(E)-2-已烯醛和(E)-2-辛烯醛具有青氣味，發(fā)花后相對含量有所增加，其主要源于脂肪酸轉化，在茯磚茶中含量明顯高于普洱茶[10]。酯類中，水楊酸甲酯增幅顯著，呈現(xiàn)冬青油草藥香，同樣為茯磚茶高于普洱茶的特征香氣成分[19]；異丁酸葉醇酯具有花果香，發(fā)花后完全消失。內酯類化合物中，二氫獼猴桃內酯具有香豆素和麝香味，發(fā)花后相對含量減少，趨勢與傳統(tǒng)茯磚茶發(fā)花過程一致[18]。

本研究發(fā)現(xiàn)，采用冠突散囊菌LJSC.2005對湖南茯茶主體黑毛茶進行發(fā)花能夠很好地促進茶葉品質轉化。感官審評結果顯示，發(fā)花能夠削弱工藝與品種對茶樣感官品質的影響，使茶樣獲得濃郁純正的菌花香味和醇厚口感。生化成分檢測結果表明，茯茶發(fā)花過程中水浸出物含量、可溶性糖含量變化趨勢與工藝相關，可可堿和咖啡堿含量變化趨勢可能與品種相關，其余物質基本呈下降趨勢。香氣檢測結果表明，黑毛茶發(fā)花后香氣種類數目增多，種類變化與傳統(tǒng)茯磚茶發(fā)花過程基本一致[18]。香氣成分中含量最多的為碳氫化合物，與Zheng等[20]研究結果不一致，可能是因為茯茶加工工藝和發(fā)花過程中涉及到的微生物種類及優(yōu)勢菌種不同所致。本研究收集的云臺大葉、櫧葉齊和桃源大葉3個茶樹品種在湖南省種植面積廣，均選育自安化群體品種，親緣關系較近；研究發(fā)現(xiàn)黑毛茶的初制工藝對于冠突散囊菌 LJSC.2005發(fā)花過程中生化成分的變化影響明顯。后期研究可選擇特異性較強或親緣關系較遠的茶樹品種制作黑毛茶，以冠突散囊菌LJSC.2005進行散茶發(fā)花，研究品種、工藝對于茯茶品質的影響，分析其滋味香氣變化，探究原料品種、制作工藝及金花菌種多因素對湖南茯茶品質的影響，以期進一步提升湖南茯茶品質。