葶丹黃復(fù)方對(duì)異丙腎上腺素誘導(dǎo)的心肌肥厚大鼠ERK1/2信號(hào)磷酸化的影響

尹 寶 譚向宇 呂志達(dá) 劉琛琛 安 炎 姜曉桐

(1 淄博市中醫(yī)醫(yī)院 山東 淄博 255300 2 齊魯醫(yī)藥學(xué)院 山東 淄博 255300)

心肌肥厚是心衰、冠心病、心律失常等諸多心血管疾病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[1]。心肌肥厚在細(xì)胞水平上表現(xiàn)為心肌細(xì)胞肥大、蛋白質(zhì)合成增加和胚胎基因激活[2]。ERK1/2是絲裂酶原激活蛋白激酶(MAPK)的主要成員之一，ERK1/2被激活后入核并使Elk-1、c-fos、p53、GATA4等轉(zhuǎn)錄因子磷酸化，進(jìn)而調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)促進(jìn)心肌細(xì)胞生長和繁殖[3]，可導(dǎo)致心室出現(xiàn)明顯的向心性肥厚[4]。本研究擬基于ERK1/2信號(hào)通路探討葶丹黃復(fù)方的抗心肌肥厚作用及其機(jī)制。

1 材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)藥物

葶丹黃復(fù)方(葶藶子20 g、酒丹參15 g、生黃芪30 g、法半夏10 g、陳皮10 g、茯苓10 g、炙甘草3 g)由淄博市中醫(yī)醫(yī)院科研中心提供，經(jīng)稱重、浸泡、煎煮3次，濃縮至1.029 g/ml(含生藥)。卡托普利片購自山東魯抗醫(yī)藥集團(tuán)賽特有限責(zé)任公司。

1.2動(dòng)物

雄性SD大鼠，SPF級(jí)，體重200-250 g，購自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，許可證號(hào)：SCXK (湘) 2013-0004，飼養(yǎng)于齊魯醫(yī)藥學(xué)院重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.3試劑

異丙腎上腺素(貨號(hào)：I5627-5G)購自美國Sigma-Aldrich公司，HE染色試劑盒(貨號(hào)：G1120)購自北京索萊寶科技有限公司，BCA蛋白定量檢測(cè)試劑盒(貨號(hào)：PA115-02) 購自北京天根生化科技有限公司，Phospho-ERK1/2 (Thr202/Tyr204)抗體(貨號(hào)：4370S)、p44/42 MAPK (Erk1/2)抗體(貨號(hào)：9102S)、β-Tubulin (貨號(hào)：2128S) 抗體購自美國Cell Signaling Technology公司。

1.4方法

36只雄性SD大鼠隨機(jī)分為6組：正常組、模型組、葶丹黃復(fù)方(5.15 g/kg、10.29 g/kg、20.58 g/kg)和卡托普利組(0.02 g/kg)，每組6只。各組(除正常組)大鼠背部皮下注射異丙腎上腺素1 mg/kg，每日1次，連續(xù)10 d；正常組大鼠背部皮下注射等劑量的生理鹽水。自由進(jìn)食，飲水。于造模次日，各治療組開始給予相應(yīng)藥物灌胃，連續(xù)14 d。給藥量按照《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》[5]所示體表面積劑量換算法計(jì)算，葶丹黃復(fù)方和卡托普利分別給予成年人0.5倍、1倍、2倍和1倍的等效劑量，正常組、模型組灌胃以相同體積的生理鹽水。

1.4.1心臟重量指數(shù)的測(cè)定

末次給藥后禁食、不禁水12 h，稱重，10%水合氯醛麻醉(0.35 ml/100 g, i.p.)，腹主動(dòng)脈采血后取心臟，生理鹽水洗凈，冰上去除心房組織、分離左右心室，濾紙吸干后，稱量左心室重、全心重。計(jì)算左心室重量指數(shù)(LVMI) = 左心室重量(mg)/體重(g)，全心重量指數(shù)(HMI) = 全心重量(mg)/體重(g)。

1.4.2心肌細(xì)胞表面積的測(cè)定

4%多聚甲醛固定左室心肌組織，經(jīng)脫水、浸蠟、包埋、切片(4 μm)后，按照HE染色試劑盒說明書行HE染色。400倍光鏡視野下觀察心肌細(xì)胞形態(tài)并拍照，每張切片隨機(jī)采取三個(gè)視野。用Image-Pro Plus 6.0軟件測(cè)量圖片中心肌細(xì)胞的表面積，每張切片隨機(jī)測(cè)量30個(gè)心肌細(xì)胞。

1.4.3 Western blot檢測(cè)Phospho-ERK1/2(p-ERK1/2)、ERK1/2蛋白表達(dá)

嚴(yán)格按照BCA蛋白定量試劑盒說明書定量分裝50 μg心肌組織蛋白樣本。上述樣本經(jīng)10%分離膠電泳后轉(zhuǎn)膜、封閉。孵以p-ERK1/2、ERK1/2抗體后行化學(xué)發(fā)光。β-Tubulin抗體作為內(nèi)參使用。

1.4.4實(shí)時(shí)熒光定量 RT-PCR檢測(cè)ANP、BNP mRNA表達(dá)

用TRIzol提取心肌組織中2 μg RNA樣本，按照試劑盒說明書操作，將RNA樣本反轉(zhuǎn)錄成cDNA，之后行RT-PCR檢測(cè)。相關(guān)引物如下：ANP(產(chǎn)物369 bp)：上游：5’- GATCTGATGGATTTCAAGAACCTG -3’，下游：5’- CAGATTTGGCTGTTATCTTCGGT -3’；BNP(產(chǎn)物252 bp)：上游：5’- AACAATCCACGATGCAGAAGC -3’，下游：5’- ACAACCTCAGCCCGTCACAG -3’；GAPDH(產(chǎn)物96 bp)：上游：5'- GTGAAGGTCGGAGTCAACG -3'，下游：5'- GGTGAAGACGCCAGTGGACTC -3'。

1.4.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 葶丹黃復(fù)方對(duì)大鼠心臟重量指數(shù)的影響

表1 葶丹黃復(fù)方對(duì)大鼠心臟重量指數(shù)的影響

2.2 葶丹黃復(fù)方對(duì)大鼠心肌細(xì)胞表面積的影響

圖1 葶丹黃復(fù)方對(duì)大鼠心肌細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響(×400)

圖2 葶丹黃復(fù)方對(duì)大鼠心肌細(xì)胞表面積的影響

2.3 葶丹黃復(fù)方對(duì)大鼠ERK1/2信號(hào)磷酸化水平的影響

圖3 葶丹黃復(fù)方對(duì)p- ERK1/2、ERK1/2、β-Tubulin

圖4 葶丹黃復(fù)方對(duì)ERK1/2信號(hào)磷酸化水平的影響

2.4 葶丹黃復(fù)方對(duì)大鼠胚胎基因ANP、BNP mRNA表達(dá)的影響

圖5 葶丹黃復(fù)方對(duì)大鼠胚胎基因ANP、BNP mRNA表達(dá)的影響

3 討論

心肌肥厚是諸多心血管疾病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[1]，在細(xì)胞水平上表現(xiàn)為心肌細(xì)胞肥大、蛋白質(zhì)合成增加和胚胎基因激活[2]。高血壓是導(dǎo)致心肌肥厚的主要疾病[6]，長期外周血壓升高會(huì)導(dǎo)致心肌代償性肥厚，最終導(dǎo)致心力衰竭的發(fā)生[7]。本研究結(jié)果顯示：與正常組比較，模型組的LVMI、HMI、心肌細(xì)胞表面積均明顯升高，差異均具有顯著性(P < 0.05)。提示異丙腎上腺素誘導(dǎo)的心肌肥厚動(dòng)物模型造模成功、模型組大鼠已形成心肌肥厚。與模型組比較，葶丹黃復(fù)方組(5.15 g/kg、10.29 g/kg、20.58 g/kg)和卡托普利組的上述各項(xiàng)指標(biāo)均有不同程度的降低，葶丹黃復(fù)方組10.29 g/kg組的上述各項(xiàng)指標(biāo)始終存在顯著性差異(P < 0.05)。該研究結(jié)果提示葶丹黃復(fù)方具有有效的抗心肌肥厚作用，且效果優(yōu)于卡托普利。

有絲分裂蛋白激酶信號(hào)通路(MAPKs)是心肌肥厚的經(jīng)典信號(hào)通路[8]，ERK1/2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與壓力超負(fù)荷性心肌肥厚的形成密切相關(guān)[3]。本研究結(jié)果顯示：與正常組比較，模型組的p-ERK1/2 / ERK1/2比率以及ANP、BNP mRNA水平均明顯升高，差異均具有顯著性(P < 0.01)。與模型組比較，葶丹黃復(fù)方組(5.15 g/kg、10.29 g/kg、20.58 g/kg)的上述各項(xiàng)指標(biāo)均有不同程度的降低，葶丹黃復(fù)方組10.29 g/kg組的上述各項(xiàng)指標(biāo)始終存在顯著性差異(P < 0.05)。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示：葶丹黃復(fù)方可以抑制ERK1/2的磷酸化，下調(diào)胚胎基因ANP、BNP mRNA的表達(dá)。

以此推斷，葶丹黃復(fù)方可能通過調(diào)控MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、抑制ERK1/2的磷酸化，進(jìn)而下調(diào)胚胎基因ANP、BNP mRNA的表達(dá)，最終實(shí)現(xiàn)其抗異丙腎上腺素誘導(dǎo)的大鼠心肌肥厚作用。