胰腺星狀細胞與胰腺疾病模型研究進展

魏 迅, 江 霞, 鄭羽旋, 張樂文, 周正宇

(1.蘇州大學實驗動物中心,蘇州 215123; 2.深圳華大生命科學研究院,深圳 518083)

胰腺作為人體器官之一，位于左上腹的胃和腸道之間，結構上分為外分泌腺和內分泌腺。胰腺具有兩大功能，分別是消化和代謝。外分泌腺主要產生胰液，其中含有大量酶；內分泌腺主要是4 種胰島細胞，負責分泌胰島素和胰高血糖素，以維持機體的血糖平衡。常見的胰腺疾病類型有胰腺炎、糖尿病和胰腺癌等。通過構建有效的動物模型研究各種胰腺疾病，逐漸成為臨床機制研究和藥物開發的熱點［1］。

胰腺星狀細胞（pancreatic stellate cells，PSCs）是胰腺組織的基質細胞，主要位于胰腺小葉間和腺泡周圍區，圍繞鄰近腺細胞基底部，約占胰腺細胞總數的4%～7%［2］。PSCs 在胰腺中有兩種形態：靜息狀態和活化狀態。活化狀態下的PSCs具有很強的增殖和遷移能力，可促使胰腺纖維化，從而引發胰腺疾病［3］。目前，關于PSCs在胰腺疾病動物模型方面的研究報告較多，而在胰腺疾病臨床發生機制及治療應用方面的研究相對較少。本文對胰腺疾病動物模型研究中PSCs發揮的作用做一綜述，探討PSCs影響胰腺疾病的可能機制，為今后預防和治療胰腺疾病的臨床研究提供新的思路。

1 PSCs

1998 年，德國科學家Bachem 等首次在人和大鼠的胰腺基質中分離出能特異性表達Ⅰ型和Ⅲ型膠原、纖連蛋白等細胞外基質（extracellular matrix，ECM）成分的胰腺基質細胞，由于它和肝臟中的肝臟星狀細胞（hepatic stellate cells，HSCs）性質十分相似，二者的細胞質內都富含能自發藍綠熒光的維生素A脂滴，故將其命名為PSCs［4］。PSCs在靜息狀態下，富含細胞質維生素A 脂滴，可特異性表達神經膠質酸性蛋白，具有較低水平的ECM 遷移能力［5］。長期飲酒和吸煙、胰腺組織壓力以及高血糖都會刺激靜息狀態的PSCs，使其產生一些有毒的代謝物和細胞因子，導致氧化應激，進而轉變為活化狀態［6］。活化狀態的PSCs特征表現為：細胞質脂滴維生素A消失，ECM遷移能力提高，特異性表達α-平滑肌肌動蛋白（alpha-smooth muscle actin，α-SMA），并分泌Ⅰ型和Ⅲ型膠原、纖連蛋白和其他ECM成分［7］。

為在胰腺疾病動物模型中探究PSCs作用的可能機制，需要提取原代PSCs。目前較為成熟的提取原代PSCs 的方法有兩種：一是用Ⅳ型膠原酶和鏈霉蛋白酶E 從膽總管逆行灌注消化，再利用碘海醇的溶解度梯度離心法分離［8］；二是利用組織塊培養法，體外無菌分離胰腺，剪碎成小塊，讓小塊的胰腺組織貼壁后加入含15%～20%胎牛血清的DMEM 培養液，置于細胞培養箱內培養，即可得到原代的PSCs［9］。

2 胰腺疾病動物模型

胰腺疾病常見有胰腺炎、糖尿病和胰腺癌等類型。目前，這幾種胰腺疾病的發病機制尚未研究清楚。建立有效的動物模型可用于研究胰腺疾病發生機制，以及開發治療藥物。以下簡單介紹用于PSCs作用機制研究的3種胰腺疾病相關的動物模型。

2.1 胰腺炎動物模型

急性胰腺炎（acute pancreatitis）是由多種因素導致胰腺出現水腫、壞死等局部炎性損傷的急腹癥之一。引起該病的常見原因主要是過量飲酒和膽石癥［10］。急性胰腺炎的發病率逐年增高，其總體死亡率約為5%［11］。目前，急性胰腺炎的發病機制尚未研究清楚，建立有效的動物模型可用于研究其發病機制和治療藥物。用于急性胰腺炎造模的實驗動物主要有大鼠、小鼠、負鼠、豚鼠、犬、貓、兔、豬、猴等［12］。

常用的急性胰腺炎動物模型是Toll樣受體4基因缺失小鼠模型。研究發現，PSCs 在胰腺炎發生發展過程中發揮著重要作用。乙醇、脂多糖等能被病原體相關模式分子識別受體如Toll 樣受體結合，激活免疫系統，同時也激活PSCs，釋放損傷相關模式分子等內源性物質，造成機體炎性因子水平升高和胰腺組織損傷［13］。活化的PSCs 還作用于促炎M1 型巨噬細胞和免疫調節M2型巨噬細胞。而巨噬細胞在急性和慢性胰腺炎中發揮著不同的潛在作用。組織學觀察發現，M2型巨噬細胞與PSCs 緊密靠近；與M1 型巨噬細胞占主導地位的急性胰腺炎不同，小鼠和人類慢性胰腺炎中胰腺組織被M2 型巨噬細胞浸潤。此外，小鼠和人的PSCs 都是白細胞介素4 受體alpha（interleukin-4 receptor alpha，IL-4Rα）配體的來源，并且可促進M2 型巨噬細胞極化。M2型巨噬細胞反過來又能有效地激活PSCs，促進“前饋”過程，該過程提示巨噬細胞在胰腺纖維化中發揮關鍵作用。值得注意的是，在患有骨髓特異性IL-4Rα缺失的小鼠或在確診疾病后接受IL-4Rα藥物抑制劑治療的小鼠中，胰腺纖維化減少［14］，因此通過抑制M2 型巨噬細胞的激活來減少PSCs 的活化，可能降低慢性胰腺炎的發病率。

2.2 糖尿病動物模型

糖尿病（diabetes mellitus）是一個日益嚴重的公共衛生健康問題，其類型主要有1型糖尿病、2型糖尿病和妊娠期糖尿病等，其中2 型糖尿病占90%以上，給社會帶來沉重的醫療負擔［15］。因此，建立理想的糖尿病動物模型將為其發病機制研究、并發癥治療及臨床新藥研發奠定基礎。目前，常用于構建糖尿病模型的實驗動物有大鼠、小鼠和斑馬魚等［16］。

糖尿病模型OLETF大鼠的研究發現，PSCs在糖尿病發生發展過程中發揮的主要作用與氧化應激和纖維化相關。在糖尿病模型OLETF 大鼠中，β 細胞會因為胰島素分泌過程高耗氧而變得缺氧，尤其是在氧氣供應不足時［17］，PSCs 在缺氧期間被激活，通過觸發腺泡細胞中異常的Ca2+信號，降低ATP 水平，引起腺泡壞死，誘導胰腺外分泌腺組織損傷；同時在胰島中觀察到α-SMA陽性的PSCs細胞數量增加，并通過細胞凋亡促進胰島β細胞死亡［18］。另外，PSCs被炎性細胞因子如轉化生長因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）激活后，細胞內壓力迅速升高，細胞外信號調節激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK）和p38 絲裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase，MAPK）發生磷酸化，進一步促進TGF-β1 和膠原蛋白的分泌［19］。用絲裂原激活的細胞外信號調節激酶（mitogen-activated extracellular signal-regulated kinase，MEK）和p38 MAPK 的拮抗劑可抑制應激誘導的α-SMA表達和細胞增殖，促進胰腺損傷和胰島β細胞凋亡，致使糖尿病癥狀加劇［19］。

2.3 胰腺癌動物模型

胰腺癌（pancreatic cancer）是惡性程度最高的癌癥之一，多發病于老年人群中。全球范圍內每年有超過41.16 萬的胰腺癌患者，且其5 年生存率低于5%［20］。胰腺癌難以診斷，往往在疾病發展到晚期才被發現。目前，胰腺癌的致病原因尚不清楚。構建胰腺癌動物模型是研究胰腺癌的有效方法。常見的胰腺癌動物模型構建方法包括向免疫缺陷鼠體內移植來源于患者的胰腺癌組織、化學誘導法如腹腔注射致癌物N-亞硝基雙胺。最近有研究發現，利用Cre-Lox技術，可針對小鼠胰腺中原癌基因Kras和抑癌基因Trp53的內源等位基因進行突變，再通過不斷雜交繁育得到轉基因LSL-KrasG12D/+;LSL-Trp53R172H/+;Pdx-1-Cre（KPC）小鼠；KPC 小鼠是研究最多的胰腺導管癌基因工程小鼠模型之一［21-22］。

在原位胰腺癌模型小鼠中，活化的PSCs類似于癌癥相關成纖維細胞，通過改變胰腺基質細胞的ECM以及分泌各種細胞因子和趨化因子發揮重要作用。胰腺癌的基質主要由PSCs 沉積的膠原纖維以及其他細胞（如肥大細胞、巨噬細胞、淋巴細胞和內皮細胞）和非細胞（即ECM）組成，這些基質成分可以介導PSCs與癌細胞之間的相互作用。PSCs 被激活后將產生大量的α-SMA 蛋白，改變了原有的胰腺基質細胞和ECM，更適應癌細胞的增殖和擴散［23］。活化的PSCs 還通過介導核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）通路的下游信號通路增加趨化因子CXCL12 受體表達，抑制細胞毒性T（CD8+T）細胞浸潤，從而使癌細胞發生免疫逃逸，最終影響胰腺癌的生物學行為和臨床結果［24］。

3 利用胰腺疾病動物模型開展的PSCs 機制研究

研究發現，在胰腺疾病小鼠模型的胰腺病理組織及血清中都能檢測出ECM蛋白以及促炎性因子，且其水平明顯高于正常組織［3］。而PSCs經過活化后具有很強的增殖和遷移能力，并且可以分泌大量ECM蛋白和促炎性因子，促進纖維化和炎性水平上升，改變了胰腺組織的微環境，最終導致胰腺疾病的發生［25］。為了更好地研究胰腺疾病的發生發展機制，有學者通過構建胰腺疾病動物模型探討了PSCs對胰腺疾病發生發展的作用及其可能的機制。

3.1 PSCs與纖維化

纖維化可發生于多種器官，主要病理特征為器官組織內纖維結締組織增多，實質細胞減少，持續進展可致器官結構破壞和功能減退，乃至衰竭，嚴重威脅健康和生命。在TGF-β1 過表達的轉基因小鼠培養過程中，發現小鼠具有慢性胰腺炎的組織形態學特征，如細胞外基質相關蛋白積累［26］。在2 型糖尿病Goto-kakizaki 大鼠模型實驗后期，通過天狼星紅染色觀察到胰島纖維化；胰島纖維化在β 細胞衰竭的進展中發揮重要作用，因為它誘導β 細胞凋亡，從而導致分泌胰島素的功能進一步受損［27］。胰腺的纖維組織主要由Ⅰ型和Ⅲ型膠原組成，PSCs是人類和實驗動物模型胰腺纖維化中Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白的主要來源，且會分泌大量炎性因子；同時TGF-β1 會促進大量ECM蛋白合成，纖維化水平不斷提高，最終引發2 型糖尿病和急性胰腺炎，甚至胰腺癌的癥狀［28］。目前，胰腺纖維化的發病機制尚未完全闡明，但其很可能來源于PSCs的激活，PSCs活化會導致大量的ECM產生，激活狀態的PSCs會快速增殖、遷移擴散，進而導致胰腺實質細胞減少，胰腺外分泌腺和胰島呈纖維化狀態［29］。簡而言之，PSCs的激活會造成胰腺纖維化，胰腺纖維化會使胰腺功能喪失，甚至協助胰腺癌細胞擴散，從而加速胰腺疾病的發生發展。

3.2 PSCs與氧化應激

在2 型糖尿病小鼠模型中，高血糖癥狀會提高氧化應激水平，刺激PSCs 活化，加劇胰腺纖維化進程，并且伴隨著活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平增高，胰腺纖維化水平也升高［30］。氧化應激與癌癥、2型糖尿病及自身免疫性疾病的發生機制有關［31］。在正常小鼠模型中，氧化應激會刺激PSCs的活化，從而分泌一些細胞因子和趨化因子，激活一氧化氮信號通路，導致急性胰腺炎等炎性疾病的發生；同時，這些活性分子可直接作用于DNA、蛋白質、脂類，也可作為功能性分子信號，激活細胞內多種應激敏感信號通路，比如MAPK 信號通路，與PSCs 的增殖、遷移能力及胰島素抵抗和胰腺β 細胞功能受損密切相關［32］。從SD 大鼠分離出的原代PSCs 在缺氧條件下被激活，激活的PSCs 與胰島β 細胞共培養后，可以促進β 細胞凋亡［18］；激活的PSCs 還可以通過影響胰島素信號轉導通路，間接抑制β細胞功能。β細胞受損后，胰島素分泌水平降低，分泌高峰延遲，血糖波動加劇，因而難以控制餐后血糖的迅速上升，對β 細胞造成更為顯著的損害［33］。PSCs 被認為在氧化應激信號通路中起到傳感器的作用，通過至少兩個第二信使向下游發送壓力信號，最終導致胰腺疾病及并發癥的發生發展［34-35］。

3.3 PSCs與炎性反應

炎癥代表了一個基本的生物學自我修復過程，通過誘導各種修復機制恢復組織的穩態。但是這種恢復可能不會充分發生，從而導致持續的應激反應，使炎性反應持續存在并且被放大，該過程導致組織功能顯著改變，體內平衡機制出現系統性和持續性紊亂，致使組織損傷［36］。在急性胰腺炎和2型糖尿病模型大鼠的血清中檢測到炎性標志物的水平明顯升高，且伴隨著胰腺組織水腫出血、纖維化加劇和胰島素分泌減少的現象，使胰腺處于長期炎癥狀態。在慢性炎癥和氧化應激的作用下，靜息狀態下的PSCs被組織的炎癥微環境持續激活，活化的PSCs激活轉錄因子NF-κB進入細胞核，誘導許多基因轉錄，調控不同的細胞，其中就包括巨噬細胞和中性粒細胞等炎性細胞的激活并迅速增殖。NF-κB 途徑還與氧化應激有關，活化的NFκB可誘導產生細胞代謝產物，刺激大量PSCs激活，進一步加劇炎癥和氧化應激，并促進胰腺細胞凋亡，從而導致氧化應激誘導的細胞功能障礙［20］。此外，活化的PSCs也會刺激巨噬細胞活化，巨噬細胞在組織炎癥的調節中發揮主要作用，巨噬細胞表現出介于兩個極端之間的表型：M1 型（促炎性）和M2 型（消炎性）。活化的PSCs又會通過旁分泌方式，分泌一些炎性因子和趨化因子，例如白細胞介素IL-6、IL-8 和TNF-α等［14］，這些細胞因子促使機體炎性反應往不可控的方向發展，使慢性炎癥持續存在并放大，加快了急性胰腺炎和2型糖尿病的進程，甚至最終轉變成胰腺癌。

4 通過靶向抑制PSCs 治療胰腺疾病的研究前景

動物模型和臨床研究均發現，活化的PSCs在胰腺疾病發生發展中起著重要作用。不同胰腺疾病的動物模型研究發現，PSCs 發揮作用主要是在纖維化、氧化應激和炎性反應等方面，提示通過抑制PSCs活化可能預防各類胰腺疾病的發生，并據此研發相關的治療藥物。未來的研究內容可以包括：開展體內和體外實驗，探究PSCs 對胰腺的損傷和致病機制；開展體內實驗，通過藥物干預探究PSCs對纖維化、氧化應激和炎性反應的作用；探究PSCs的狀態，或者通過提取胰腺疾病模型動物體內的原代PSCs，在體外實驗研究其與胰腺其他細胞的互作關系，進一步驗證PSCs對胰腺功能的影響，為研究和開發此類疾病的治療藥物提供基礎。

4.1 從纖維化的角度治療胰腺疾病

PSCs 的激活是胰腺纖維化發展的重要過程，可導致2型糖尿病和胰腺導管癌［37］。活化的PSCs已被認為是胰腺纖維化的關鍵起始分子，也是胰腺癌的重要標志［38］。一些特定的植物提取物可作為新的抗纖維化制劑，例如姜黃素（curcumin）可用于靶向治療胰腺纖維化以及抑制PSCs活化和腫瘤干細胞增殖，其治療原理是抑制血小板衍生生長因子的增殖誘導作用，使活化的PSCs 和腫瘤干細胞停滯在G0/G1期，最終使細胞凋亡，減少細胞外基質蛋白的產生［39］。此外，鞣花酸（ellagic acid）能夠抑制c-Raf/MAPK/ERK 和PI3K/AKT下游信號通路的激活，這些信號通路對PSCs細胞增殖和遷移很重要；而且鞣花酸可以通過降低α-SMA蛋白和ECM 前膠原Ⅰ、Ⅲ型蛋白水平，使PSCs 失活［40］。因此，抗纖維化療法已被確定為是一種通過靶向抑制PSCs活化治療胰腺疾病的新策略。

4.2 從氧化應激的角度治療胰腺疾病

從氧化應激的角度調控PSCs達到治療胰腺疾病的目的，主要是通過抗氧化劑干預來實現。已知大量飲酒會造成急性胰腺炎，其原理是乙醇通過氧化應激反應來激活PSCs，促使PSCs的細胞膜脂質過氧化，以及總超氧化物歧化酶過量表達。而綠茶中的綠茶多酚主要活性成分表沒食子兒茶素沒食子酸酯（epigallocatechin-3-gallate，EGCG）具有抗氧化、抗炎、抗動脈粥樣硬化和抗癌作用。研究發現，EGCG 預處理可以抑制乙醇誘導的體外PSCs 活化［41］。已知乙醇能夠顯著增加α-SMA 蛋白（Ⅰ型前膠原）表達，激活TGF-β1，并誘導p38 MAPK 磷酸化。而EGCG 治療能夠顯著降低所有這些因子的生成，并且徹底消除p38 MAPK 磷酸化［41］。此外有研究證實，EGCG 可以通過調節線粒體氧化應激和炎性反應，下調HSCs 中促纖維化標志物（如Ⅰ型膠原蛋白、纖連蛋白和α-SMA）的基因表達，減弱ROS 誘導的肝細胞死亡，從而減少肝纖維化［42］。而HSCs 和PSCs 的性質類似，提示EGCG 也可能通過減少胰腺纖維化，預防胰腺疾病的發生。

另有研究發現，白藜蘆醇（resveratrol）通過下調微RNA21（microRNA21，miR21）表達、增加張力蛋白同源物（phosphatase and tensin homolog，PTEN）蛋白水平來阻止ROS誘導的PSCs活化、侵襲、遷移和糖酵解；進一步研究證明，白藜蘆醇可以通過抑制ROS/miR21 介導的PSCs活化和糖酵解來抑制胰腺癌細胞的侵襲和遷移，達到靶向治療胰腺癌的目的［43］。

4.3 從炎性反應的角度治療胰腺疾病

靜息狀態的PSCs 因機體處于炎癥狀態而被激活，活化的PSCs通過NF-κB途徑分泌一些趨化因子和生長因子，從而介導和加劇炎癥。所以，通過誘導PSCs凋亡，可抑制NF-κB的穩定性和轉錄活性，加速組織從炎性反應中恢復。例如常見的糖尿病治療藥物二甲雙胍，通過重編程PSCs和腫瘤相關巨噬細胞可減輕胰腺癌患者炎癥，對活化的PSCs具有抑制增殖和促凋亡的作用，可減弱NF-κB途徑造成的炎性反應，一定程度上減緩了2型糖尿病的癥狀［44］。姜黃素類似物L49H37通過降低ERK1/2 激酶的磷酸化水平，下調p21 水平，導致G0/G1期依賴性細胞周期停滯，抑制活化的PSCs增殖并誘導凋亡，減少了眾多炎性因子的旁分泌，降低組織炎癥損傷水平［45］。

綜上所述，在急性胰腺炎、2型糖尿病和胰腺導管癌動物模型中，活化的PSCs 能夠促進胰腺組織纖維化，在氧化應激信號通路中發揮傳導功能，促使機體炎性反應，導致胰腺疾病的發生。因此，靶向抑制PSCs的活化能夠減輕胰腺細胞的損傷，減緩胰腺疾病的發生發展，這可能為治療胰腺疾病提供了一種新思路。