殼聚糖脫乙酰度的測定及其應用研究進展

王一迪，古 淵，謝 嫚，游清徽

（江西師范大學生命科學學院，江西南昌 330022）

殼聚糖廣泛存在于各類動物、植物和真菌中，被認為是自然界中存量僅次于纖維素的天然多糖類物質[1]。殼聚糖主要來源于甲殼素，是甲殼素脫N-乙酰基的產物，其氨基具有很強的親核性，能夠發生N-烷基化等一系列反應。通常來講，甲殼素中的N-乙酰基脫去55%以上后就可被稱為殼聚糖。脫乙酰的程度決定了氨基在多糖分子鏈上的含量，脫乙酰程度越高，殼聚糖在稀酸溶液中由于氨基質子化而產生的帶電基團就越多，導致其結構上的變化與性質上的差異。因此，脫乙酰度（degree of deacetylation，DD）是殼聚糖生產中一個重要的質量和工藝指標[2]。同時，殼聚糖具有安全無毒、環境友好、可自然降解等特性，被廣泛應用于醫藥[3]、食品[4]、農業[5]、環保[6]、紡織[7]、美妝[8]、生物工程[9]等領域。本文綜述了殼聚糖脫乙酰度的各類測定方法并進行比較，討論了其優點和局限性，并圍繞不同脫乙酰度的殼聚糖在多個領域中的應用展開討論，為殼聚糖產品的質量控制和應用提供參考依據。

1 殼聚糖脫乙酰度的測定

殼聚糖脫乙酰度的檢測方法大致可分為三類[10]。第一類是化學分析方法，包括堿量法[11]、膠體滴定法[12]、電導滴定法[13]、電位滴定法[14]和線性滴定法[15]等；第二類是光譜學方法，有紅外吸收光譜法[16]、紫外吸收光譜法[17]、核磁共振波譜法[18]等；第三類是破壞性方法，包括差示掃描量熱法[19]、元素分析法[20]、解離法[21]和X射線衍射法[22]等。同時，近年來也有相關學者開發出了新型的電特性測定法。本文綜述了目前所有報道的幾種殼聚糖脫乙酰度測定方法及其改進方案，同時比較各種檢測方法的優勢和不足，總結見表1。

1.1 化學分析法

1.1.1 酸堿滴定法 酸堿滴定法的依據，是殼聚糖脫乙酰基后產生的自由氨基呈堿性，能夠與酸定量發生中和反應，然后通過滴定測量體系中多余的氫離子，即可推算出與氨基結合的氫離子含量，進而推算出殼聚糖的氨基含量和脫乙酰度。通過酸堿滴定法測定氨基含量時使用的指示劑通常為甲基橙[11]，但在滴定終點時溶液由橙色變為黃色，顯色不夠明顯。印琦等[23]采用甲基橙-亞甲基藍作為指示劑對酸堿滴定法加以改良，在滴定終點時溶液由紫色轉變為淺綠色，測定結果準確度達到97.01%，相較于單獨使用甲基橙作為指示劑時更好判斷，提高了實驗的準確性和可重復性。此類方法需要將殼聚糖配制成溶液后進行測定，這就對殼聚糖樣品的分子量和脫乙酰度范圍有一定的要求，也可能受到溶液中其他雜質的干擾而影響其測定精度。

基于酸堿滴定法的原理，何煒欣等[24]采用光纖折射率傳感器的檢測方法，以光纖折射率傳感器實時動態檢測滴定過程中樣品溶液的光折射率，能夠非常便利、精確地判斷滴定終點。當以雙突躍法滴定結合光纖折射率傳感器進行檢測時，三種殼聚糖樣品的脫乙酰度分別為（88.0%±1.1%）、（92.2%±0.9%）、（96.1%±0.8%），而根據1H NMR得出三者的脫乙酰度分別為87.0%、91.0%和95.1%，二者相差不大。該結果表明，將光纖折射率傳感器測試系統用于殼聚糖的脫乙酰度檢測是可行的。這種方法的核心測量裝置不需要額外的電子元件，能夠避免電磁波干擾，具有易于搭建、操作簡便、響應速度快等優點。但不可忽略的是，該方法同樣會受到殼聚糖溶液粘稠、渾濁特征的影響，導致測試結果的可靠性下降。

1.1.2 庫倫滴定法 庫倫滴定法是通過在電極上發生電解反應，產生的氫氧根離子在殼聚糖溶液中與反應剩余的HCl發生反應，依據法拉第公式計算殼聚糖的脫乙酰度。WANG等[25]通過實驗得出，當以1 mol/L KCl溶液作為電解質，15.00 mA恒定電流強度，以復合玻璃電極作為指示電極，以雙鉑電極-鉑絲輔助電極作為工作電極對，pH3.80為滴定終點，測量四份樣品得到的脫乙酰度均與核磁共振氫譜的檢測結果相近，標準差小于0.5%。隨后，WANG等[26]又對庫侖滴定法做出改進，采用雙突躍庫侖滴定法分析殼聚糖的脫乙酰度，通過兩次突躍之間的電解時間差，即可得出殼聚糖的脫乙酰度，同時消除由殼聚糖溶液中殘留的酸或堿所引起的測量誤差，測試結果表明，四個樣品的脫乙酰度與核磁共振測定的結果一致，標準偏差低于0.60%。庫侖滴定法直接通過電解來產生氫氧根，根據兩次突躍之間的電解時間差能夠直接計算殼聚糖中質子化的氨基含量，有效避免了溶液中殘留酸或堿的干擾，精密度較好，操作簡單，并且分析時間也較快，15 min即可得出結果，但其對電解質的種類和濃度都有一定要求。雙突躍庫侖滴定法在檢測過程中使用銻電極取代玻璃電極，提高了檢測的靈敏度，克服了玻璃電極在粘稠、渾濁的殼聚糖溶液中的應用缺陷。但是，庫倫滴定方法及改進的雙突躍庫侖滴定法都有一個共同的缺陷，就是只能檢測溶解性較好的殼聚糖，對殼聚糖的相對分子量有一定要求，同時也容易受到內源性雜質的干擾，穩定性不佳。

1.2 光譜學方法

1.2.1 紅外光譜法 殼聚糖殘留的酰胺基團具有獨特的紅外吸收峰，使得紅外光譜法（IR）成為測定殼聚糖脫乙酰度光譜學方法中最常用的一種。殼聚糖的脫乙酰度不同，則分子中酰胺基團參與形成的鏈內、鏈間氫鍵的數目也不同，導致酰胺峰位發生變化。在樣品的紅外光譜圖中，不同基團會呈現出不同的吸收區域，通過參照品中酰胺的特征吸收峰與其總吸收峰之間的比例，結合殼聚糖樣品的總吸收峰，即可推算出殼聚糖的脫乙酰度。

選擇合適的吸收峰、參照峰以及基線，對紅外光譜測定殼聚糖的脫乙酰度非常重要[27]。其特征吸收峰大多選擇1655、1550和1310 cm?1等，而參照峰常用3450、2877 cm?1等。現有文獻采用了多種不同的吸收帶比，例如A1320:A1420[28]、A1655:A3450[29]、A1560:A1030[30]等。林瑞洵等[31]發現1655 cm?1處的吸收峰受樣品含水的影響較大，1550 cm?1處吸收峰受到的影響則較小。DONG等[32]分析后認為使用A1560:A2880的吸收帶比測定效果最好，并且在相鄰兩個波谷之間建立連接，對于測量1560 cm?1和1655 cm?1譜帶的吸光度更好。測量范圍幾乎覆蓋了脫乙酰度的整個范圍（1%~100%），并且優化了1655 cm?1峰受到樣品中含水的干擾問題。同時，當殼聚糖的脫乙酰度過高（大于90%）時，由于酰胺基團的吸收峰很弱，紅外光譜檢測中很容易受雜質干擾，影響測定結果的準確度。

DIMZON等[33]使用偏最小二乘（PLS）來對紅外光譜測定結果進行分析，使得檢測準確度得到了顯著改善。該研究采用1500 cm?1至1800 cm?1的紅外光譜區數據集，采用不同的PLS模型對該數據集進行處理、評估和比較。對PLS載荷圖的分析表明，光譜區域中的重要變量來自1660 cm?1和1550 cm?1處的酰胺譜帶和1600 cm?1處的酰胺譜帶相關的吸收最大值。與常規的紅外吸收率法相比，IR-PLS結果更加精確和可靠。FATIMA[34]還采用了傅里葉變換紅外光譜（FTIR）追蹤從甲殼素提取殼聚糖過程中的脫乙酰度變化，從而跟蹤了甲殼素到殼聚糖的轉化過程。

紅外光譜法的優勢在于不用將殼聚糖樣品配制成溶液，進而測定一些難溶的殼聚糖樣品，操作中一般使用溴化鉀壓片法，即將干燥后的殼聚糖樣品與溴化鉀混合并研磨成粉末，壓片后再進行分析。樣品中的內源性雜質對測定的影響較小，但需要專業儀器才能完成測定，限制了該方法的應用場景。

1.2.2 拉曼光譜法 ZAJAC等[35]還開發出了一種使用拉曼光譜測定殼聚糖脫乙酰度的方法。拉曼光譜法與紅外光譜法的原理相近，通過測定殼聚糖在拉曼光譜中的特征吸收峰來計算殼聚糖的脫乙酰度。檢測中以896 cm?1作為參照譜帶，而非采用受殼聚糖樣品中水分影響較大的C-H伸縮震動譜帶作為參照，提高了測定的準確性。拉曼光譜的優點是樣品中的水分、無機鹽和蛋白質等雜質均對檢測結果無影響，從而保證了檢測的準確度。

1.2.3 核磁共振波譜法 核磁共振波譜法（NMR）是一種應用廣泛的化合物結構解析方法，常用的有1H NMR[36]、13C NMR[37]、15N NMR[38]等。其中1H NMR被廣泛認為是測定殼聚糖脫乙酰度最為準確的方法，常被用作其他測定方法的校準和對照[39]。1H NMR是利用殼聚糖分子中不同氫質子具有不同的化學位移值，以核磁共振波譜圖中氫質子的積分面積和對照氫質子的積分面積做比較，來計算出殼聚糖的脫乙酰度。13C NMR的原理與前者類似，檢測的是羰基中的碳峰面積。TANG等[40]提出了一種根據交叉極化互易關系，使用SSNMR13C方法測定甲殼素含量和殼聚糖的脫乙酰度。這是基于交叉極化互易關系改進的固體核磁共振定量方法（rQCPZRCSSNMR），將其用于殼聚糖脫乙酰度的測試。選擇三個甲殼素或殼聚糖樣品以評估rQCPZRC的性能，與定量測試法和最佳接觸時間法相比，rQCPZRC被證明是一種準確可靠的脫乙酰測試方法，相對誤差小于5%。此外，每個樣品的rQCPZRC實驗時間為5.5 h，明顯短于雙脈沖定量分析法（DP）的36~85 h。因此，使用rQCPZRC作為脫乙酰度的測試工具，能夠精準和高效地測定殼聚糖的脫乙酰度。15N NMR的計算最為簡單，通過核磁共振得到氨基信號峰和乙酰胺信號峰，通過峰強度的比值來得出殼聚糖的脫乙酰度。但13C NMR和15N NMR的檢測準確性較低，且操作繁瑣程度相當，故在應用上還是將1H NMR作為核磁共振波譜法中的最優選[37]。核磁共振波譜法的局限性在于所需儀器昂貴，操作也非常復雜，需要專人經培訓后才能操作，這使得這種方法很難被推廣和應用。

1.3 破壞性方法

1.3.1 差示掃描量熱法 差示掃描量熱法（DSC）是一種常用的熱分析方法，通過檢測樣品的物理性質隨溫度和時間的變化，來分析物質分子結構[19]。利用甲殼素和殼聚糖在高溫條件下能夠解離成兩種特定單體的性質，檢測人員采用DSC來測定殼聚糖的脫乙酰度。GUINESI等[41]通過DSC測定殼聚糖脫乙酰度時在296和404 ℃時出現了兩個放熱峰，峰高度與峰面積的比值與殼聚糖樣品的脫乙酰度之間呈現良好的線性關系。紀建華[42]將DSC測定與紅外吸收光譜法進行比較研究，結果表明，殼聚糖DSC曲線中選用295 ℃分解峰與紅外光譜測定中選用A1320:A1420得到的脫乙酰度結果相近，同時也接近于樣品標稱的脫乙酰度，僅稍微偏高約1%。紀建華[43]又將DSC測定與和電位滴定法加以比較，DSC檢測結果與作為參照的1H NMR測定結果最大相差不到1%，且四組平行試驗的標準偏差均小于1.5%，表明DSC檢測有較好的精密度；此外，通過對兩種方法穩定性的考察，發現電位滴定法的測定值會隨著樣品溶液放置時間的延長而逐漸增加，穩定性相對較差的最大相差為3.92%，而DSC法沒有明顯變化，最大相差僅為1%。由此可見，DSC法和紅外光譜法一樣，都屬于測定準確度較好的一類方法，檢測速度快，并且同樣擁有廣泛的脫乙酰度測定范圍。然而，該方法需要專門的檢測設備，因此產生了一定的局限性。

1.4 電特性測定法

1.4.1 毛細管區帶電泳法 WU等[44]開發了一種毛細管區帶電泳（CZE）的方法來測定殼聚糖的脫乙酰度。殼聚糖是一種陽離子多糖，其脫乙酰度可以通過電泳遷移率的分布來表征，因此毛細管區帶電泳是一種合適的檢測方法，通過測定殼聚糖電泳遷移的速率與1H NMR測定的脫乙酰度，在二者之間建立線性校準方程式，實現了55.3%~96.2%脫乙酰度殼聚糖樣品的測定。值得強調的是，該方法不僅可以獲得殼聚糖樣品的平均脫乙酰度，而且還可以從電泳色譜圖中獲得不同批次殼聚糖的脫乙酰度分布信息。THEVARAJAH等[45]使用游離溶液毛細管電泳（CE）度來分離不同脫乙酰度的殼聚糖，根據殼聚糖樣品電泳遷移率分布的分散性可以表征殼聚糖的脫乙酰度，并與1H NMR檢測得到的脫乙酰度數建立了對應關系，同樣取得了較好的結果。但是，毛細管區帶電泳法不可避免地要依據1H NMR檢測的結果作為參照，這就使得測試的前期準備工作變得復雜且耗時，從而限制了該方法的推廣應用。

1.4.2 感電特性測定法 利用感電特性來評估殼聚糖的脫乙酰度是由LI等[46]提出的一種新型檢測方法。該研究旨在通過基于感應方法的模擬電分析系統確定固定相對分子質量殼聚糖的脫乙酰度。相關研究表明，導電性液體食品的物理化學性質能夠通過其感電特性加以表征[47]。將其應用于殼聚糖，原理大致為：在硅鋼芯的一側用銅絲纏繞作為初級線圈（Np），將導電性溶液（殼聚糖乙酸溶液）填充在硅鋼芯的另一側的玻璃螺旋管（或聚四氟乙烯管）中，使之成為次級線圈（Ns）。在初級線圈上施加的初級電壓（Up）會在鋼芯中產生交變磁通，從而導致殼聚糖線圈中產生感應電壓（Us）。根據變壓器原理[48]Up/Us=Np/Ns，其中Up和Np/Ns都是固定的，所以Us為一常數。殼聚糖中氨基含量的差別會導致其感電特性的差異[49]，而阻抗的變化會導致殼聚糖線圈中的Us變化，所以通過測量殼聚糖的感應電參數，即可對應表征殼聚糖的脫乙酰度值。但是，該方法目前只能檢測固定相對分子質量的殼聚糖溶液，這是由于殼聚糖的聚合度也會影響其氨基含量[50]，因此該方法更加適用于同批次固定相對分子質量殼聚糖樣品的檢測，而非殼聚糖混合物的質量控制。

2 不同脫乙酰度殼聚糖的應用

2.1 高脫乙酰度殼聚糖的應用

脫乙酰度達到85%（甚至90%）以上的殼聚糖就可以稱之為高脫乙酰度殼聚糖[51]。高脫乙酰度殼聚糖由于游離氨基含量高，在抗菌、保鮮、防腐和抗氧化等方面都表現出良好的作用，故而在食品工業中得到了廣泛的應用。

2.1.1 抗菌 殼聚糖抗菌機理主要包括兩個方面：一是當殼聚糖分子中帶正電荷的氨基吸附于細菌細胞表面時，會形成一層阻礙物質運輸的高分子膜，影響細胞正常的新陳代謝，從而起到抑菌作用[52]；二是這些游離氨基能夠和細菌細胞壁中帶負電的磷壁酸結合影響其生理功能，破壞細胞壁合成，進而改變了細胞膜的屏障性能，引起菌體形變，導致質壁分離[53]。趙維等[54]比較了不同脫乙酰度蠶蛹殼聚糖的抑菌性能，結果顯示，隨著樣品脫乙酰度的增加，抑菌活性也逐漸增大，對白色念珠球菌、大腸桿菌、蠟狀芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌等都表現出了明顯的抑制作用。賈秀春等[55]用殼聚糖對豬肉進行抗菌處理也得到了類似的結果。各種海產廢料，如蝦殼、蟹殼等都是重要的殼聚糖產品來源，VALE 等[56]從蟹殼中提取了脫乙酰度為92%的高脫乙酰度殼聚糖，分別以濃度為1.5%和0.6%的甘油配制成殼聚糖甘油膜溶液，同樣表現出良好的抗菌活性。由此可見，殼聚糖分子中游離氨基的含量是使其發揮抑菌作用的關鍵，高脫乙酰度的殼聚糖其抗菌效果會更好。

殼聚糖與金屬離子結合制備復合材料，可以加強其抗菌活性[57]，例如銀離子會與帶負電的大分子相互作用，引起蛋白質變性、細胞壁變形，最終導致細胞死亡[58?59]，因此，殼聚糖與金屬離子的復合材料預期效果更好。

2.1.2 保鮮 殼聚糖作為一種天然防腐劑能夠有效保鮮，抑制食品氧化、褐變和產生異味[60]。研究表明，高脫乙酰度的殼聚糖能夠有效抑制肉類中的脂質水解，其機理在于殼聚糖作為一種堿性多糖，具有大量的游離氨基，能夠和游離脂肪酸充分結合，發揮良好的抗氧化活性[61]。歐春艷等[62]研究了不同脫乙酰度的殼聚糖對黃瓜的保鮮效果，采用脫乙酰度70%~90%的各種殼聚糖作為保鮮劑，結果顯示高脫乙酰度的殼聚糖更能減少黃瓜中的水分、葉綠素和維生素C的流失，降低黃瓜的腐爛率。因此，殼聚糖的脫乙酰度越高，保鮮效果越好。

將殼聚糖的成膜性應用于食品包裝也是近年來的研究熱點。將殼聚糖與天然大分子有機物如蛋白質、多糖及不同抗菌物質如抗生素、有機酸、植物提取物等結合制備涂層用于食品包裝，能夠有效提升食品的抗菌能力，延長其保存時間。

呂勇等[63]考察了不同脫乙酰度涂布包裝紙的力學性能和抗油脂性能，結果表明，隨著涂布的殼聚糖脫乙酰度的提高，包裝紙力學性能得到提升。其原因可能是殼聚糖分子與紙張纖維素之間的氫鍵作用力與脫乙酰度呈正相關。

將高脫乙酰度的殼聚糖和茶多酚復配制成復合保鮮膜，不僅提高了保鮮膜中的總酚含量，還提高了其對2,2-二苯基-1-苦基肼自由基的清除活性，大幅增強了殼聚糖保鮮膜的抗氧化性能，同時膜的機械強度和水蒸氣阻隔性能也得到了提升[64?65]，在水果[66?68]、蔬菜[69?70]、水產品[71?72]和肉類[73?74]等的保鮮領域都呈現出巨大的發展潛力。

2.2 中低脫乙酰度殼聚糖的應用

一般稱脫乙酰度在55%~85%的殼聚糖為中低脫乙酰度殼聚糖[51]，此類殼聚糖在組織工程和環保等領域具有獨特的應用。

2.2.1 組織工程 殼聚糖作為一類堿性陽離子聚合物，不溶于水，同時具有良好的可塑性和可加工性，將其加工或改性制成薄膜、微球或者多孔的組織工程材料，能夠為細胞生長提供良好的支撐和貼附作用[75]。用于人體的組織工程材料的一個重要特性是具有合適的體內降解性，殼聚糖可以被溶菌酶緩慢水解，因此具有合適的降解性，如今已成為生物和醫療材料領域的研究熱點[76]。殼聚糖的降解速度與其脫乙酰度密切相關，將其應用于軟骨損傷修復時，使用脫乙酰度為80%左右的殼聚糖作為支架原料，可以讓殼聚糖支架的降解速度與人體軟骨正常修復的時間相吻合，從而發揮最佳的治療效果[77]。此外，殼聚糖還對人體原代成骨細胞的生長和分化有一定的影響，研究表明低脫乙酰度的殼聚糖海綿能夠促進破骨細胞生成因子的分泌[78]。為了有效調控并引導骨再生的速度和質量，可以通過使用不同脫乙酰度的殼聚糖原料加以實現。

2.2.2 環保 殼聚糖作為一種高分子凝絮劑和吸附劑，在水處理以及保水材料等領域發揮著重要的作用。通過將中脫乙酰度的殼聚糖與丙烯酰胺和陽離子單體進行三元共聚合，一方面能夠增強改性殼聚糖的溶解性，另一方面還保持了聚合物足夠的相對分子質量與電荷密度，使其更容易對雜質顆粒進行架橋吸附和電中和[79]。同時，不同的脫乙酰度也使得殼聚糖對不同的重金屬元素有著不同的去除效率。例如，中低脫乙酰度的殼聚糖薄片和珠粒則對鉛的去除效果更好[80]。中低脫乙酰度殼聚糖還能夠作為保水材料，將殼聚糖丙烯酸酯類的高吸收性聚合物（SAP）作為保水材料，對保護植被、涵養水源都有著很好的效果。相關研究表明，當使用低相對分子質量和低脫乙酰度的殼聚糖時，SAP的吸水性更強[81]。

3 總結和展望

殼聚糖在傳統食品工業和醫療保健行業中的應用極為廣泛，在抗菌、保鮮和包裝材料方面具有巨大的應用潛力。然而，對于殼聚糖的研究開發仍處于逐漸深入的過程，暫時難以完全替代相關的食品添加劑和防腐劑，正因如此，還需要研究者對殼聚糖進行全面且深入的檢測、復配和改性研究。絕大多數情況下，殼聚糖必須標注其脫乙酰度。為了保證殼聚糖脫乙酰度測定的效率、準確性與可推廣性，有必要繼續探索更加簡便、快速、準確的測定方法。現有的脫乙酰度測定方法中，化學分析法和光譜分析法由于其簡便快捷的特性，被廣泛應用于食品、醫藥等諸多領域。不同脫乙酰度的殼聚糖也發揮出了不同的功能特性，高脫乙酰度殼聚糖的抗菌保鮮能力受到重視，中低脫乙酰度的殼聚糖則在醫學和環保領域發揮重要作用，通過進一步探索殼聚糖脫乙酰度的測定方法，相信能夠為擴展其更加廣泛的應用提供助力和參考。