發酵魚中菌群組成及發酵特性研究進展

孫海鑫，陳智慧，王盛美，韓 軍，孫紀錄,

（1.河北農業大學食品科技學院，河北保定 071000；2.云南省曲靖農業學校生物技術學部，云南曲靖 655000；3.河北農業大學現代科技學院，河北保定 071000）

魚類食品被認為是人類食物資源中不可或缺的一部分，不同魚類的各種加工食用方式在悠久的歷史中不斷演化改進。發酵是魚類產品加工手段中極其重要的加工方式[1]，起初是作為魚肉保鮮的手段出現的[2]。隨著魚類產品的消費量不斷增加，發酵方法得以不斷改進[3]。世界各地的發酵魚種類豐富多樣，歷史悠久，是一種傳統的特色美食[4]。發酵也從保藏手段逐漸變為加工手段。因地理位置差異，世界各地的發酵魚有不同類型的加工制品（見圖1），風味也因此迥異富有特色[5?6]。例如，在印度尼西亞地區的鹽漬發酵魚Jambal roti和Budu[7]；瑞典地區的即食酸鯡魚產品Surstr?mming[8]；柬埔寨地區的發酵魚制品Prohok[9]；冰島地區的腌制鯊魚肉Hákarl[10]；亞洲是發酵魚的主要市場，尤其是在中國，發酵魚類型有貴州和湖南地區的酸魚、安徽地區的臭鱖魚、廣東地區的糟魚、潮汕地區的魚露、海南地區的魚茶等各種發酵制品[11]。發酵魚具有營養價值高、地域風味強、制備條件簡易等特點，諸多研究均展現出發酵魚是人體蛋白質、礦物質、微量元素的重要來源，其營養對人體健康和膳食均衡起到一定影響[6]。例如，Siscovick等[12]的研究中發現魚油對預防糖尿病、心腦血管疾病和中風的優勢。Najafian等[13]從發酵魚中分離出的抗氧化活性肽用作功能性食品成分和藥物時可預防疾病，增強人體體質。

圖1 發酵魚分類Fig.1 Classification of fermented fish

魚肉發酵的關鍵是微生物和酶，對發酵魚中的微生物菌群和功能性菌的研究有利于制備優良發酵劑提高發酵魚產量和品質，縮短發酵時間，提高工業化生產的穩定性[14?15]。在發酵過程中，各種微生物相互作用將發酵原料中的各種大分子物質代謝分解成易被身體消化吸收的小分子活性物質[16]，從而使得發酵成品的發酵時間、質地、風味、營養含量、香氣成分等均發生顯著變化[17?20]，一些微生物的發酵產物還能起到調節免疫系統[21]、預防某些疾病的作用[13]。目前人們對很多類型發酵魚產品中的微生物菌群組成尚未有太多了解，因此對發酵魚食品中的微生物菌群及其在發酵過程中的功能特性進行研究對發酵魚產業發展和產品質量提高都具有重要意義。對發酵魚食品微生物組成和發酵特性進行綜述，為發酵魚領域發展提供理論資料。

1 發酵魚中的微生物

發酵魚的核心詞是發酵，發酵離不開微生物的代謝活動，不同地區因環境和發酵原料的差異導致發酵魚中的微生物有很大差異。不同的優勢菌種因代謝差異導致了各種類型的發酵魚之間風味、質地、色澤、安全性差異顯著[22]。發酵魚中有兩類主要的微生物，一部分是有益微生物，包括乳酸菌、微球菌、酵母菌、葡萄球菌，另一部分主要是有害微生物，包括一些腸道菌、金黃色葡萄球菌、產胺菌等會產生對人體有害的代謝物質[23?25]。自然發酵魚肉制品中的微生物往往因粗放的加工方式導致發酵菌群更加復雜，腐敗微生物的生長也難以得到有效抑制。除了傳統的發酵方式，很多研究通過添加發酵劑和發酵輔料進行發酵魚的制作，添加發酵劑的方式（乳酸菌產生細菌素）能夠有效控制腐敗微生物的滋生[26]，發酵香辛料也能起到抑制產胺菌等有害微生物生長的作用[27]，從而保證發酵魚在發酵質量上的可控性。

1.1 傳統發酵魚中的微生物

傳統發酵魚的工藝主要是自然發酵，魚本身的微生物和發酵過程中的控制水平使得傳統發酵魚中微生物組成較為復雜，優劣菌并存于發酵制品中，大大限制了發酵魚制品的質量和食用安全性。見表1。

表1 常見的自然發酵魚制品Table 1 Common naturally fermented fish products

1.1.1 乳酸菌 乳酸菌是通過發酵碳水化合物產生乳酸的一類厭氧或兼性厭氧的球狀或桿狀菌株。發酵魚制品在發酵過程中產生了令人滿意的變化，乳酸菌在其中扮演了重要角色。乳酸菌主要有乳桿菌屬、雙歧桿菌屬、鏈球菌屬、明串珠菌、片球菌屬等[11]。乳酸菌形態多樣，但不具備孢子，運動性能較差，耐氧能力較強，乳酸菌通過自身產生的乳酸降低發酵過程中的pH進而抑制腐敗微生物的生長繁殖。不僅如此，異型乳酸發酵菌產生的乙醇、乙醛、乙酸等香味物質，促進了發酵制品風味的形成[34]。

目前已有大量關于發酵魚制品中乳酸菌的研究，劉璐等[35]在貴州黔東南地區的魚醬酸中分離出15 株典型的產γ-氨基丁酸的乳酸菌，包括2株食竇魏斯氏菌、1株雄峰魏斯氏菌、11株植物乳桿菌和1株戊糖乳桿菌，其中植物乳桿菌Y279和Y64展現出良好的耐酸、耐鹽、抑菌特點，可作為工業化生產的優良菌株。Harnentis等[7]在印度尼西亞本地發酵魚中分離得到了10 株乳酸菌，鑒定為乳桿菌屬，革蘭氏陽性桿菌。Han等[36]在自發發酵的魚茶中分離得到3株乳酸菌，包括2株植物乳桿菌和1株乳酸乳球菌。胡錦鵬等[11]對發酵魚中乳酸菌的重要地位進行概述，闡明了乳酸菌在發酵魚制品過程中的關鍵作用。林城杏[37]通過研究傳統高鹽發酵酸魚，在6組樣品中共分離到42株優良乳酸菌，其中24株為植物乳桿菌，占比高達57.14%，說明高鹽發酵酸魚的第一優勢菌株為植物乳桿菌。在其他發酵食品中也有相似結果[38?39]，發酵過程中的優勢菌多為乳酸菌，特別是在發酵魚制品中，乳酸菌中的植物乳桿菌是發酵魚制品的關鍵微生物。

1.1.2 葡萄球菌 葡萄球菌是一種發酵過程中的優勢微生物，很多葡萄球菌在發酵過程中都能分泌酶來促進水產品的色澤、質地和風味的形成[40]。葡萄球菌的顯著特點就是具有硝酸鹽還原酶活性，在發酵肉制品時能夠將NO3?還原為NO2?，當發酵魚類時因為較低的pH，NO2?自然分解為NO，此時NO與魚肉中的肌紅蛋白相結合產生亞硝基肌紅蛋白而使肉質呈現出誘人的紅色[30]。目前，東南亞地區及日本地區的傳統發酵魚研究中分離出較多的葡萄球菌。Majumdar等[41]在印度傳統發酵魚Sheedal中分離到7株葡萄球菌，即S. piscifermentans、S. condiment、S. arlettae、S. sciuri、S. warneri、S. nepalensis和S. hominis，這7株葡萄球菌均表現出蛋白質水解和脂解的活性特點。Kanjan等[42]在泰國發酵魚Budu中分離得到的葡萄球菌PMRS35在模擬胃腸道條件下，存活率達80%以上。Ngari是印度東北部的一種傳統發酵魚食品，Khusro等[43]在Ngari中分離得到對病原體抑制活性較強的腐生葡萄球菌，呈現出高耐酸性、疏水性和自聚集性的特點。

1.1.3 酵母菌 在魚肉制品發酵中，酵母菌對發酵也有積極的促進作用。發酵初期的酵母菌數量一般較少，在發酵成熟到保藏期間酵母菌數量才有所增加[30]。Zeng等[44]在傳統低鹽（2%~3%）發酵酸魚中共分離得到110株具有典型形態的酵母菌，并通過PCR和生化方法鑒定為釀酒酵母（70.9%）和異常漢遜酵母（29.1%），其中五株表現出較強的益生菌性狀和理化性質，該研究通過篩選耐逆性（pH、溫度、鹽濃度）和蛋白水解、脂解活性較好的釀酒酵母菌來制作發酵劑，提高發酵質量。陳柔霖等[45]在魚蛋白酶解液中分離得到7株酵母菌，經產香試驗篩選出一株最佳產香酵母Y2，鑒定為長孢洛德酵母。

1.1.4 霉菌 從目前研究來看，霉菌在發酵魚微生物區系中也是占有一定的數量。謝莉等[46]在傳統發酵魚露中分離到耐鹽性霉菌，分子生物學鑒定為橘青霉（Penicillium citrinum），溶血性實驗未出現溶血現象，通過轉錄組技術研究高鹽脅迫下的代謝作用，該霉菌可縮短發酵時間。楊穎等[47]為克服速釀魚露風味較差的缺陷，在魚露中篩選出一株米曲霉作為后續實驗的發酵劑，以大米作為種曲并配合分段加鹽工藝有效的縮短了鳀魚魚露的發酵周期。米曲霉在高鹽和低酸環境下活性較低，還有可能產生雜菌，因此霉菌在發酵魚制品中的使用還需要進一步研究。

霉菌在魚肉制品的發酵中作為優勢菌出現多依靠人工接種為主，霉菌作為發酵劑進行肉制品發酵時會產生一定的風險，在選擇霉菌菌種接種時要進行嚴格的菌種篩查工作，以此保證發酵的安全性。

1.2 人工接種發酵魚中的微生物

由于自然發酵過程中微生物種類難以控制，導致自然發酵食品的品質會受到極大的影響。自然發酵由于添加不同比例的發酵原料，間接的也會影響到微生物菌群的變化。例如，食鹽添加量較高會使某些不耐鹽微生物難以成為發酵優勢菌。由于自然發酵的不穩定性，接種發酵劑來增強發酵能力，縮短發酵周期，為工業化生產提供穩定的發酵方式提供了技術手段。與傳統的自然發酵相比，接種發酵劑的發酵方式優勢更加明顯。見表2。例如，使特定的功能性菌株成為優勢菌株，進而達到預期的發酵目標，通過優勢菌株來抑制雜菌污染，提高發酵安全性；獲得清晰的發酵進程，使發酵變得更容易控制，大大縮短發酵周期，降低了發酵的成本；利用特定的菌種代謝物來抑制某些有害物質的形成[49?50]。近年來，為提高發酵質量、縮短發酵周期、抑制生物胺等有害產物，應用復合發酵劑能夠充分利用菌種間的協同作用加快發酵進程、提高產品質量。

表2 優良發酵劑的發酵特點Table 2 Fermentation characteristics of excellent starter

石健喜等[51]在傳統發酵魚中分離出植物乳桿菌、木糖葡萄球菌和釀酒酵母制成復合發酵劑進行發酵發現乳酸菌逐漸成為鰱魚發酵過程中的優勢菌，葡萄球菌在發酵24 h后增長速度變慢，可能是由于逐漸降低的pH抑制了葡萄球菌的生長，發酵36 h后，假單胞菌、腸桿菌明顯受到抑制，可能是由于pH及抑菌物質的影響。Zhao等[52]采用黑曲霉和米曲霉混合發酵的方法，發現氨基酸、可溶性氮、游離氨基酸和谷氨酸的含量相較于只采用米曲霉發酵有不同程度的增加。試驗結果均表明，采用混合發酵劑發酵魚肉制品，氨態氮、游離氨基酸的含量得到提高，香氣增加明顯。

Zang等[53]利用高通量測序在研究有無接種發酵劑發酵酸魚的微生物群落動態后發現，無論是否包含發酵劑培養物，乳酸菌、巨球菌、葡萄球菌都是整個發酵過程中的主要細菌。在接種發酵劑的樣品中，酵母菌是發酵早期的主要菌類，到發酵后期主要菌類變為念珠菌和威克漢姆菌。與天然發酵的樣品相比，接種發酵劑的樣品對乳球菌、明串珠菌、腸球菌、弧菌、鐮刀菌和孢圓酵母等均有抑制作用，對金黃色葡萄球菌的產生有顯著的抑制作用[53]，該研究表明了混合發酵劑的接種抑制了許多導致食品變質微生物的生長。

Gelman等[54]利用分離到的乳酸菌作為發酵劑接種到魚糜中，在10 ℃培養7 周后發現魚糜中菌株特異性較強，在接種植物乳桿菌和腸膜明串珠菌的樣品中對競爭菌群的抑制作用明顯強于其他接種樣品。Liao等[55]以植物乳桿菌、木糖葡萄球菌和釀酒酵母復合發酵劑接種樣品，發現樣品中的乳酸菌含量要明顯高于接種了木糖葡萄球菌或釀酒酵母單一菌種樣品中的乳酸菌數量。韓靜[33]研究不同溫度下自然發酵魚茶的菌群分布發現，各組中的優勢菌株在發酵第3周后開始確立，發酵魚茶在15 ℃發酵條件下的優勢菌株為沙克乳酸桿菌和植物乳桿菌，在20 ℃和25 ℃條件下的優勢菌株是植物乳桿菌，30 ℃條件下的優勢菌株是短乳桿菌。Zheng等[56]在研究中分離到一株嗜鹽冷桿菌對pH和NaCl變化影響不明顯，顯著提高了嗜鹽微生物的數量，進而加速了魚露發酵進程。有研究表明，乳酸菌在發酵過程中快速產酸的同時，對腐敗菌種和致病菌生長繁殖具有抑制作用[57]。吳永祥等[58]在研究臭鱖魚發酵中指出傳統的臭鱖魚發酵得益于微生物菌群的系統發酵，實現臭鱖魚的接種定向發酵需要篩選形成特殊風味的微生物，并了解微生物菌株的發酵機理、各種微生物間的協同作用及發酵環境條件。

2 發酵魚中優勢菌種的發酵特性

傳統發酵魚制品中的微生物是復雜多樣的，微生物類型與發酵質量密切相關，了解優勢菌種對提高各種原有大分子物質的降解能力，減少有害物的產生和提高發酵魚制品的品質具有重要意義，見圖2。對優勢菌種的特定功能進行研究，將微生物的組成與代謝作用相結合，能更加清晰地了解到微生物與魚肉中物質的作用機理[59]，從而篩選特定的優勢菌種作為發酵劑，穩定發酵過程，達到提高發酵質量的目的，為工業化生產發酵魚制品提供理論支持。

圖2 優勢微生物發酵作用機理Fig.2 Fermentation mechanism of dominant microorganisms

2.1 抑制腐敗微生物生長

乳酸菌作為發酵魚制品中的優勢菌株，對食源性病原體和腐敗菌均有抑制作用[60]。乳酸菌能代謝合成各種抗菌性化合物，如有機酸、雙乙酰、羅伊氏菌素、細菌素[26]等。劉璐等[35]在魚醬酸中分離出的15株乳酸菌能夠快速產酸，表現出較強的耐酸、耐膽鹽性，抑菌實驗中抑菌液有明顯抑菌圈，研究表明植物乳桿菌Y64和Y279若作為發酵劑接種能快速產酸抑制不耐酸微生物的生長。童火艷[61]利用大腸桿菌和枯草芽孢桿菌作為指示菌，對5株乳酸菌（乳酸片球菌、發酵乳桿菌、植物乳桿菌、短乳桿菌和干酪乳桿菌）抑菌能力進行測定，發現植物乳桿菌的抑菌能力最強。林城杏[37]在發酵酸魚中篩選出產細菌素乳酸菌對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌有明顯抑制效果，且菌株具有良好的耐鹽、耐酸、耐熱特性。根據以上研究發現，乳酸菌中植物乳桿菌抑菌能力更加突出，作為發酵劑可快速產酸，顯著降低環境的pH，抑制腐敗微生物的生長繁殖。

2.2 促進大分子物質降解

發酵魚肉中的脂肪降解程度對品質有著重要的影響。不同的微生物對脂肪降解效率有顯著差異[62]。Xu等[62]在酸魚中接種植物乳桿菌120、木糖葡萄球菌135和釀酒酵母31，發現接種發酵劑樣品中的游離脂肪酸含量有不同程度的增加，表明接種的發酵劑可以促進游離脂肪酸的脂解和釋放，其中木糖葡萄球菌135具有更高的脂肪分解活性。有報道指出，利用植物乳桿菌、木糖葡萄球菌和釀酒酵母菌發酵酸魚后單不飽和脂肪酸與多不飽和脂肪酸含量均有大幅增加，進一步研究得出木糖葡萄球菌可促進脂質降解，延緩脂肪酶活力下降速率，酵母菌則可以抑制磷脂氧化，對不飽和脂肪酸的抗氧化能力較強[48,63]。脂質降解是魚肉發酵過程中重要的生化變化，目前研究指出酵母菌中的釀酒酵母和葡萄球菌中的木糖葡萄球菌對脂質降解起到關鍵作用。

蛋白質降解也是發酵過程中的重要生化反應，葡萄球菌在代謝過程中能分泌蛋白質降解酶，木糖葡萄球菌和肉葡萄球菌的混合發酵劑有助于發酵肉制品中蛋白質的降解[14]。高繼慶等[64]接種木糖葡萄球菌發酵海鱸魚發現游離氨基酸含量隨發酵時間延長而增加，發酵60 h后，含量增加61.07%，并且木糖葡萄球菌在發酵過程中能利用氨基酸生長代謝。魚肉中的蛋白質包括肌漿蛋白、肌原纖維蛋白和不溶性蛋白[65]，發酵過程中蛋白質降解引起氨基酸含量和TCA-溶解肽含量上升，表明木糖葡萄球菌對蛋白質中的肌漿蛋白和肌原纖維蛋白降解有重要影響。

2.3 提高發酵魚品質

微生物在發酵魚風味形成中扮演著重要角色，傳統發酵魚氣味主要包括醛、醇、酮、酸、酯類、含氮、硫化合物等成分，在接種發酵劑的魚制品中醛和醇類為主要的揮發性氣味物質[66]。張洵等[19]以乳酸菌和酵母菌為發酵劑接種到魚糜中進行發酵，酵母菌可以分解碳水化合物中的醇并與乳酸菌產生的酸生成酯類，賦予魚糜特殊的酯香。Zang等[20]在鯉魚中接種發酵劑，在發酵樣品中共檢測到17種游離氨基酸、22種游離脂肪酸和81種香氣物質，其中乳酸菌參與了大部分風味物質的形成，葡萄球菌、腸球菌、酵母菌、念珠菌也對風味形成起到了積極作用。朱露露等[67]將酵母菌作為發酵劑接種到鱘魚中產生了乙酸乙酯、乙酸異戊脂和3-甲基丁醛等風味物質。李春生等[68]在魚制品發酵過程中檢測到387種菌參與風味形成，在發酵后檢測出54種揮發性氣味化合物，其中嗜鹽單胞菌與風味物質2-甲基丙醛呈正相關關系，表明嗜鹽單胞菌可能會促進發酵過程中麥香味的形成，并對除三甲胺外的8種風味形成起到促進作用。發酵魚肉制品香味的形成多歸功于酵母菌[19]，其中釀酒酵母和畢赤酵母是發酵魚制品中常見的酵母菌發酵劑。

生物胺是發酵魚食品中常見的一類有害化合物，生物胺對人體有一定的積極作用，但是當積累量超過一定限度時，則會引起頭疼、心悸、嘔吐等毒性作用[69]。由于發酵魚食品中生物胺的存在，研究減少生物胺含量對提高發酵魚發酵質量具有重要意義。一直以來，許多研究均報道了微生物在培養基、緩沖液和發酵食品中降解生物胺的能力。朱翠翠等[70]在天然發酵的魚露中分離出一株對組胺具有高效降解能力的畢赤酵母菌株，在組胺濃度為50 mg/L時降解率高達82.61%，進一步研究顯示該菌株對組胺、酪胺、尸胺、腐胺、色胺、β-苯乙胺、亞精胺和精胺均有不同的降解能力。在發酵魚產品中，魚露的平均生物胺水平較高，接種發酵劑發酵魚露可以減少或預防生物胺的形成[71]。袁樹坤[72]在魚露優勢微生物與生物胺相關性研究中發現在整個魚露發酵期間亞精胺和精胺是主要的生物胺，其含量與顯性假單胞菌屬、變形桿菌屬、普羅威斯登菌屬含量呈負相關，四聯球菌屬被認為是減少魚露發酵過程中生物胺含量的主要微生物。劉忠義等[73]在魚糜中接種乳酸菌和酵母菌作為混合發酵劑進行發酵發現魚糜中腐胺、組胺、酪胺、精胺和亞精胺的含量相較于未接種的發酵魚糜明顯降低。目前，有關發酵魚中生物胺降解菌的研究集中在乳酸菌（乳桿菌）、葡萄球菌、酵母菌（釀酒酵母、畢赤酵母）、霉菌（紅曲霉）幾種微生物中[74]，因此選擇合適的優勢菌作為發酵劑是降低生物胺的關鍵生產步驟。

3 結論與展望

發酵是魚制品加工的重要方式，魚肉風味、質地、色澤、營養能夠在發酵過程中得到增強。目前，大多數發酵魚制品工業化程度較低，傳統發酵魚肉制品微生物區系復雜，發酵過程中往往會產生雜菌，導致發酵質量參差不齊；接種發酵劑培養優勢菌發酵魚肉能夠獲得良好的產品品質。微生物代謝活動在魚肉發酵中扮演著重要的角色，特別是優勢菌種在發酵過程中起到抑制雜菌生長、促進蛋白脂肪降解、抑制有害物產生、增加產品風味的作用。關于發酵魚制品中微生物組成和品質特征的關系還需要不斷地深入探索，將發酵劑發酵技術和代謝組學技術及高通量測序技術等相關領域學科知識結合起來應用，對發酵魚制品品質和市場開發具有重大意義。