光纖耦合微通道反應系統原位監測海水氨氮和亞硝酸鹽的研究

姜雙城 ，杜虹，鄭惠東，湯新華 ，潘文濤，高俊，范丹陽，林琪*，呂海霞，林旭聰,

( 1. 福建省水產研究所，福建 廈門 361013；2. 汕頭大學 理學院，廣東 汕頭 515063；3. 廈門斯坦道科學儀器股份有限公司，福建 廈門 361013；4. 福建省產品質量與食品安全檢測試劑和儀器工程技術研究中心，福建 福州 350108；5. 福州大學 化學學院，福建 福州 350108)

1 引言

氨氮和亞硝酸鹽是海水中營養鹽的重要組成部分，當氨氮和亞硝酸鹽濃度過高時，不僅會破壞水體氮循環的平衡，而且會導致藻類數量異常增加，引發水體富營養化，破壞海洋水體原有的生態平衡，并危害近海養殖業的健康發展，亟需監控[1-4]。隨著國家藍色海洋戰略推進，營養鹽監測需求日益增加，研發氨氮、亞硝酸鹽等分析技術及其儀器設備，推進快速、準確的原位監測受到了廣泛重視。

目前，海水中氨氮和亞硝酸鹽的檢測方法發展日趨成熟，主要包括分光光度法、熒光法和電化學法等。光譜法分析儀器操作簡單、成本低，在海水中氨氮和亞硝酸鹽現場檢測中得到了廣泛的應用。在氨氮檢測方面，水楊酸-次氯酸鈉比色法[5-6]、靛酚藍分光光度[7]和鄰苯二甲醛熒光法[8-9]得到了廣泛的研究和 應 用；結 合 流 動 注 射 技 術，?raj等[10]、Vrana等[11]和Zabiegala等[12]基于膜分離的氣體擴散單元引入液芯波導流通處，消除海水鹽度差影響，提出了海水痕量氨測定的新方法。對于亞硝酸鹽，分光光度法[13-14]、化學發光法[15]和色譜法[16-17]等得到了長足的發展?；贕riess偶聯反應，采用分光光度法實現了水樣中的亞硝酸鹽測定[18-19]；基于對氨基苯硫酚的偶氮化反應，發展了比色法和表面增強拉曼光譜（SERS）兩種模式對亞硝酸根離子進行檢測[20]。然而，值得注意的是，現有方法中的儀器對于熒光和分光光度普遍采用傳統的光路檢測模塊，兩種光分析方法原理不同、光路設計不同，通常難以在同一個檢測模塊中應用，需要分別開發不同的檢測模塊，這樣就會導致檢測儀器在檢測元器件和反應流路上數量大幅增加。對于海洋原位監測儀器而言，集成化、小型化尤為重要，特別在浮標等載體狹小空間中，儀器的檢測流程增加和元器件的增加，十分不利于儀器集成和高效利用。亟需開發可同時兼容熒光、分光光度法的原位監測成套技術和儀器，促進原位監測儀器的集成化、小型化。

針對上述問題，本文基于光纖波導技術，采用光波長切割、光纖波導和微通道反應Z型檢測池等技術，提出了光纖耦合微通道反應系統，將不同波長和檢測原理的氨氮熒光分析和亞硝酸鹽光度分析模式耦合在同一套系統，實現了海水中氨氮熒光檢測和亞硝酸鹽吸光光度法的原位測定。本文采用光導纖維傳感技術，將Y型光纖探頭直接插入Z型微通道流通池中進行測定，光輻射經光纖傳導、熒光激發和發射，將反應池中熒光光譜光纖接收傳回信號檢測器；或通過傳導光纖經由Z型流通池直接吸收，實現光度法測定。實驗分析討論了熒光和可見光光度法檢測模式切換分析的可行性，研究了溫度、pH、鹽度和濁度的變化對海水中氨氮、亞硝酸鹽測定的影響，并對不同環境參數變化所引起的偏差進行了補償校正，研發了一種光纖耦合微反應系統原位測定氨氮、亞硝酸鹽的方法及儀器。應用于海水樣品進行了分析和比對驗證，實現了海水氨氮和亞硝酸鹽原位監測儀器更好的集成化設計和應用。

2 材料與方法

2.1 儀器與試劑

所需試劑：磺胺（分析純，上海國藥）、鹽酸（分析純，天津福晨化學試劑）、鹽酸萘乙二胺（分析純，南京化學試劑）、鄰苯二甲醛（分析純，阿拉丁試劑公司）、亞硫酸鈉（分析純，天津試劑）、四硼酸鈉（分析純，上海國藥）、氯化銨（優級純，上海國藥）、亞硝酸鈉（分析純，西隴化工）。

氨氮標準溶液（1 000 mg/L）：優級純氯化銨經100℃干燥，稱取3.819 g溶于適量的超純水，移入容量瓶中，用超純水稀釋至1 000 mL并混勻，溶液濃度為1 000 mg/L；其他濃度根據需要依次稀釋得到。

亞硝酸鈉標準溶液（1 000 mg/L）：亞硝酸鈉經110～120℃干燥，準確稱取0.150 g溶于適量的超純水中，移入容量瓶用水稀釋至100 mL并混勻，溶液濃度為1 000 mg/L；其他濃度根據需要依次稀釋得到。

光纖耦合微通道反應系統（自制），使用前采用超純水清洗管路和前端過濾單元；實驗用水為超純水（默克密理博公司，美國）。

2.2 光纖耦合微通道反應系統

如圖1所示，氙燈光源發射的光波波段經由波長切割器選擇，入射光經由Y型光纖一分為二，由傳導光纖1和2分成兩束相同狀態的光，其中傳導光纖1直接連接信號采集器，設置為參比光路，傳導光纖2經由Z型微通道流通池，產生的光譜信息由信號采集系統采集，兩者完成樣品的吸光光度法測定；同時，傳導光纖2與傳導光纖3組成Y型光纖，傳導光纖2入射樣品激發產生熒光，傳導光纖3在同側方向上采集樣品熒光并傳輸到信號采集器，完成熒光探測。

圖1 光纖耦合微通道反應系統原位檢測裝置示意圖Fig. 1 Schematic of the fiber-coupled micro-channel reaction system for in-situ detection

2.3 本法和標準方法的比對驗證

在原位監測儀開展現場測試的同時，使用QCC15卡蓋式采水器（2.5 L）采集水樣，并用0.45 μm醋酸纖維濾膜過濾水樣；過濾后的樣品，冷藏運輸至實驗室，實驗室內水質分析準則依據《海洋監測規范第4部分：海水分析》（GB 17378.4-2007）[21]和《近岸海域環境監測規范》（HJ442-2008）[22]，氨氮和亞硝酸鹽的測定使用連續流動分析儀（型號：Skalar San++)評價本法和標準方法測定結果的一致性。

3 結果與討論

3.1 原位檢測儀器光譜分析

依據2.2節，對于氨氮分析，如圖2a所示，在堿性條件下，海水中的氨氮與鄰苯二甲醛（OPA）、亞硫酸鈉生成具有熒光性的異吲哚衍生物，在波長362 nm的入射光激發下產生波長425 nm的熒光，熒光信號隨著氨氮的濃度增大而增強。如圖2b所示，在酸性介質中，亞硝酸鹽與磺胺發生重氮化反應，與顯色劑鹽酸萘乙二胺偶合生成紅色偶氮染料，最大吸收波長為540 nm，吸光度信號隨著亞硝酸鹽濃度的增大而增大。實驗表明，該方法建立的光纖耦合微通道反應系統中氨氮和亞硝酸鹽的反應光譜特征，與文獻報道[13-14]的基本一致，所建立的反應模塊中熒光和可見光光度法檢測的模式切換分析具有可行性。

圖2 不同濃度氨氮的熒光光譜（a）和亞硝酸鹽的吸收光譜（b）Fig. 2 Fluorescence spectra (a) and absorption spectra (b) of ammonia nitrogen and nitrite with different concentrations, respectively

3.2 不同環境因子對氨氮和亞硝酸鹽測定的影響

3.2.1 海水溫度對氨氮和亞硝酸鹽測定的影響

如圖3a所示，考察了海水溫度對氨氮原位監測結果的影響，在24 h內每小時采樣1次，曲線1（黑色，未恒溫）的熒光信號波動較為激烈，熒光信號平均值為385，信號漂移值為-17.0%，水溫對于氨氮檢測的熒光強度影響較大。為了消除溫度的影響，微通道反應系統（含Z型微通道流通池）采用加熱裝置加以溫度控制，如曲線2（紅色，恒溫），熒光信號變化波動明顯減少，熒光平均值為411，信號漂移值為-2.0%，數值較為穩定。同時，如圖3b所示，氨氮的熒光信號也隨著溫度升高略有升高，25～30℃之間的熒光值相對較強，無明顯提升，考慮到溫度升高能耗較大且容易降低儀器元器件壽命，故實驗選用25℃作為反應溫度。

同時，實驗考察了不同水溫樣品進入體系中對于亞硝酸鹽的響應情況。如圖3b所示，隨著水溫的增加，亞硝酸鹽反應體系（540 nm處）吸光度值變化很小。結合上述研究結果，實驗采用25℃為微反應體系的反應溫度，該條件下熒光強度和吸光度檢測穩定。

圖3 溫度對氨氮檢測熒光強度（a）和亞硝酸鹽吸光度（b）的影響Fig. 3 Effect of temperature on fluorescence intensity of ammonia nitrogen detection (a) and absorbance of nitrite (b)

3.2.2 pH對氨氮和亞硝酸鹽測定的影響

實驗分析了海水pH在6～10之間對氨氮測定熒光強度、亞硝酸鹽測定吸光值的影響。如圖4所示，隨著海水pH的增大，氨氮測定的熒光強度基本保持在420左右，強度略有增強；亞硝酸鹽測定的吸光值穩定，數值保持在0.20左右，研究表明海水pH變化對于氨氮測定的熒光強度、亞硝酸鹽測定的吸光值影響較小，反應體系較為穩定。

圖4 pH對反應熒光強度和吸光度的影響Fig. 4 Effects of pH on fluorescence intensity and absorbance of the reaction

3.2.3 鹽度和濁度對氨氮和亞硝酸鹽測定影響

如圖5所示，隨著海水鹽度的增加，不同濃度的氨氮樣品測定時，反應體系的熒光強度逐漸降低并趨向平穩，在鹽度20～35之間基本穩定。另外，實驗采用紅土和泥沙調制不同濁度，通過0.45 μm濾膜過濾后測定氨氮濃度，考察濁度對氨氮測定的影響，如表1所示，對不同氨氮濃度的樣品，前后測定誤差較小，濁度對氨氮測定的誤差為-6.6%～2.5%；氨氮濃度較高的樣品測定誤差較小，濁度對氨氮測定結果影響較弱。

圖5 鹽度對氨氮測定熒光強度的影響Fig. 5 Effects of salinity on fluorescence intensity for ammonia nitrogen detection

表1 濁度對氨氮測定的影響Table 1 Effects of turbidity on the determination of ammonia nitrogen

在亞硝酸鹽測定方面，如圖6所示，對于 NO-2濃度不變的海水樣品，隨著海水鹽度（X軸）的增加， NO-2測定吸光度逐漸增強， NO-2測定輸出值與真實值之間的變化量逐漸增大（Y軸）；同時，隨著Z軸濁度的增加，NO-2測定輸出值與真實值之間的變化更加明顯。研究表明，鹽度和濁度對于分光光度法檢測亞硝酸鹽測定的影響較大，需要進行合適的補償校正。

圖6 鹽度-濁度-亞硝酸鹽濃度變化量的曲面圖Fig. 6 Surface plot of salinity-turbidity-nitrite concentration variation

（1）不同鹽度下對亞硝酸鹽吸光度影響的補償校正

如圖7所示，當海水鹽度為20時，亞硝酸鹽測定反應的吸光度較低，亞硝酸鹽補償前的測定值與真實值基本一致；當鹽度大于20后，反應體系的吸光度值發生較大的變化，其吸光度（y）與鹽度（x）呈正相關性，對鹽度在20～35范圍內的吸光度進行擬合，表達式為y=-0.000 08x2+0.005 4x+0.131 6，據此可以計算出不同鹽度下吸光度的校正系數為0.881～0.950。因此，結合不同鹽度時的吸光度、對應的校正系數以及標準溶液濃度測定曲線，可以實現對亞硝酸鹽濃度進行校正和定量測定，如圖7所示，亞硝酸鹽濃度真實值與預測值間的相對誤差不超過2.1%，可以有效控制鹽度對亞硝酸鹽測定的影響。

圖7 不同鹽度下亞硝酸鹽預測值及鹽度補償結果Fig. 7 Predicted values of nitrite and salinity compensation results under different salinities

（2）濁度對吸光度的影響和補償校正方程

研究表明，當濁度小于40 NTU時，吸光度值基本穩定，測定值與對照值較為接近；當濁度大于40 NTU時，隨著濁度的增加，溶液吸光度值逐漸降低，從0.20降低至0.18，亞硝酸鹽測定值偏離真實值較為明顯，濁度帶來的影響不可忽略。如圖8所示，在濁度為40～120 NTU區間時，吸光度值與濁度呈顯著負相關，亞硝酸鹽濃度和真實濃度間的變化量（y）與濁度（x）的關系為y=0.116 2x-2.94，R2=0.999 7。結合不同濁度時的吸光度值和標準曲線模型即可進行濁度補償，如圖8所示，補償后兩者數字接近，有效消除濁度對亞硝酸鹽測定的影響。

圖8 不同濁度下亞硝酸鹽溶液預測值及補償結果Fig. 8 Predicted value and compensation result of nitrite under different turbidity

為了進一步說明補償后的測定效果，采用整體平均偏差Bias的計算，如式（1）所示：

式中，為模型的預測值；yi為真實值；n為校正樣本數。

整體平均偏差Bias值越小，模型的補償效果越好，根據圖8計算得到濁度補償后光譜數據模型的Bias為0.056 μg/L，且真實值與預測值間的相對誤差不超過0.1%，表明補償模型可基本消除樣品濁度的影響。

3.3 方法性能檢驗

3.3.1 線性范圍、檢測限和重現性

以人工海水空白為參比，測定0濃度為標準空白的熒光強度Ab，測定不同濃度樣品熒光強度為Aw；以熒光強度變化值（Aw-Ab）為縱坐標，樣品濃度為橫坐標繪制標準曲線，測得氨氮濃度的線性范圍為10～125 μg/L，R2=0.999 2；亞硝酸鹽濃度的線性范圍為5～600 μg/L，R2=0.999 7。根據檢出限（DL）=3a/k，其中，a為空白測定標準偏差，k為工作曲線斜率，計算得到氨氮、亞硝酸鹽的檢測限分別為2.4 μg/L、1.2 μg/L。

為了確定方法的重現性，采用海水樣品加標測試，進行5次重復測定，氨氮濃度為50 μg/L與100 μg/L的樣品，相對標準偏差分別為5.4%和3.5%；亞硝酸鹽濃度為80 μg/L的樣品，日內相對標準偏差（RSD）為3.3%，日間RSD為4.8%，兩者檢測均具有較好的穩定性。

3.3.2 海水測定及方法比對

采集實際海水水樣，分別使用原位監測儀和國標法，在實驗室內進行靜態水樣的測定，測定結果如表2、表3所示，所建立的光纖系統（OPA法）對氨氮的測定結果與國標法進行比較，相對誤差為-6.3%～6.6%；亞硝酸鹽的測定結果與國標法測定的結果相差不大，相對誤差最大不超過4.9%，表明在水體處于靜態的情況下，所建立的光纖系統能夠較準確地測定海水中氨氮和亞硝酸鹽濃度。

表2 實驗室內氨氮檢測結果對比Table 2 Comparison of test results of ammonia nitrogen in laboratory

表3 實驗室內亞硝酸鹽檢測結果對比Table 3 Comparison of test results of nitrite in laboratory

3.3.3 原位測定及方法比對

實驗進一步評估了原位監測儀現場監測養殖海水中氨氮和亞硝酸鹽濃度的準確性，在福建省海水魚繁育基地養殖池（24°21′46′′N，118°02′57′′E）開展為期兩周連續測定和比對試驗。每天定時啟動原位監測儀的同時，對同深度、同時刻采集的海水樣品，采用GB 17378.4-2007方法分析測定氨氮和亞硝酸鹽濃度，兩者進行比對。如表4、表5所示，氨氮（濃度在6.0～83.5 μg/L范圍內）的原位監測與實驗室方法測定結果相對偏差范圍在-16.9%～18.8%；亞硝酸鹽（濃度在0.8～7.8 μg/L范圍內）的原位監測與標準法測定結果相對偏差范圍在-18.0%～15.0%，兩者測定結果基本相符，相對誤差在±18%區間內，較長時間內的監測結果具有較好的一致性；部分水樣中氨氮和亞硝酸鹽濃度較低，這部分水樣濃度落在原位儀器檢測定量限以下，這部分比對結果不能計算。結果表明，本法所提出的原位監測儀能夠克服養殖海水中復雜環境參數對氨氮和亞硝酸鹽測定結果的干擾，基于簡便的光纖耦合微通道反應系統，分別實現海水中氨氮和亞硝酸鹽較為準確的原位監測。

表4 現場水樣氨氮原位監測結果對比Table 4 Comparison of in-situ monitoring results of ammonia nitrogen in field water samples

續表 5

表 5 亞硝酸鹽原位檢測結果對比Table 5 Comparison of in situ detection results of nitrite in field water samples

續表4

4 結論

本文基于光波長切割、光纖波導和注射式微通道反應—Z型池檢測系統，制備了一種新的原位光譜分析光纖檢測裝置，僅需一套裝置即可實現熒光和紫外可見光度法兩種檢測模式，分析簡便、高效。海水pH變化對該系統原位監測結果的影響較小，溫度、鹽度和濁度對亞硝酸鹽和氨氮測定結果則具有較大干擾。本法通過添加恒溫裝置來消除影響，實現了微通道反應系統的穩定性；通過光譜吸光度校正數學模型進行校正，消除了鹽度和濁度所造成的不利影響。在最佳條件下，氨氮、亞硝酸鹽的原位監測濃度線性范圍分別為10～125 μg/L和5～600 μg/L，檢出限分別為2.4 μg/L、1.2 μg/L；應用于養殖水中氨氮和亞硝酸鹽的連續兩周監測分析可知，儀器原位監測與標準方法的測定結果相符，相對偏差分別為-16.9%～18.8%，-18.0%～15.0%，較長時間內監測結果具有良好的一致性。本文所提出的技術在同一模塊中可實現氨氮和亞硝酸鹽的熒光和分光光度兩種模式的原位監測，分析檢測結果較為穩定和準確，可為海水中氨氮、亞硝酸鹽的原位監測儀器更好的集成化設計和穩定的應用提供新技術。