小鼠模型在消化道黏膜免疫及感染性疾病研究中的應(yīng)用進(jìn)展

于士顏

(1.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院上海精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)研究院,上海 200125;2.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院腫瘤科,上海 200125)

微生物在地球生命圈內(nèi)無處不在，在微觀尺度上形成動(dòng)態(tài)演化的微生態(tài)系統(tǒng)，它能適應(yīng)并改造自然環(huán)境，同時(shí)參與宏觀生態(tài)系統(tǒng)的生化分子循環(huán)、能量傳遞，甚至遺傳信息交換。致病性微生物可以在物種內(nèi)甚至物種間播散，造成傳染性疾病；同時(shí)，高致死性傳染性疾病加重了物種進(jìn)化篩選壓力，甚至影響物種存亡［1］。除自養(yǎng)微生物外，許多微生物需要寄居于宿主提供的特定空間內(nèi)，并與宿主相互作用（簡(jiǎn)稱互作）以適應(yīng)環(huán)境演化。人體黏膜表面定殖著上百兆級(jí)微生物，與人體形成穩(wěn)定的共生關(guān)系［2］。這種共生關(guān)系對(duì)宿主健康與疾病等生理病理活動(dòng)產(chǎn)生重要影響［3］。一方面，共生微生物形成的穩(wěn)定生態(tài)有助于抑制其他致病病原體的侵入，同時(shí)通過其代謝次生產(chǎn)物與其固有模式組分共同刺激宿主免疫系統(tǒng)發(fā)育、成熟，從而調(diào)節(jié)人體各組織器官的生理功能及免疫穩(wěn)態(tài)［4-5］。另一方面，西方化飲食與不良生活習(xí)慣誘導(dǎo)菌群生態(tài)紊亂，可造成攜帶易感基因的宿主免疫系統(tǒng)異常活化，進(jìn)而誘發(fā)免疫相關(guān)性疾病。另外，有些飲食經(jīng)腸道菌群處理后可產(chǎn)生有毒性的代謝產(chǎn)物，毒性物質(zhì)可促進(jìn)代謝相關(guān)性疾病甚至腫瘤的發(fā)生［6-7］。不少病原微生物亦可利用共生菌群創(chuàng)造的生態(tài)環(huán)境，促進(jìn)該病原體定殖并破壞宿主屏障，從而造成感染發(fā)生［8-11］。

以前由于微生物培養(yǎng)條件與手段有限，大部分微生物的功能研究均未得到充分開展。近年來借助高通量測(cè)序技術(shù)與生物信息學(xué)高級(jí)算法，特定微生物與宿主正常免疫生理以及相關(guān)疾病的相關(guān)性研究取得了不少重要進(jìn)展［12］。而研究宿主與微生物互作對(duì)宿主生理與病理生理的影響，探尋因果關(guān)系，常需要借助模式生物。根據(jù)微生物定殖的自然宿主譜，可以從果蠅、線蟲等低等生物到小鼠、豚鼠等嚙齒類動(dòng)物，以及靈長(zhǎng)類動(dòng)物等來選擇模式生物［13］。本文將介紹近年來利用小鼠模型在消化道黏膜免疫及感染性疾病研究中的部分重要進(jìn)展與挑戰(zhàn)，并對(duì)未來如何整合小鼠資源與環(huán)境暴露等要素提出觀點(diǎn)，便于更好地認(rèn)識(shí)人與微生物互作對(duì)人類健康與疾病的影響及其機(jī)制。

1 小鼠模型在黏膜免疫與感染性疾病研究中的應(yīng)用進(jìn)展

影響人類健康與疾病的某些微生物可以跨物種定殖，而有些微生物，尤其是病原微生物，僅能感染人類等有限種屬，這為選擇合適的模式動(dòng)物帶來了挑戰(zhàn)。相對(duì)其他動(dòng)物模型，小鼠作為模式動(dòng)物的基礎(chǔ)研究相對(duì)更加充分，很多宿主與微生物互作研究的突破性發(fā)現(xiàn)都源于對(duì)小鼠資源的合理應(yīng)用，如小鼠模型在推動(dòng)腸道菌群與黏膜免疫研究中發(fā)揮了關(guān)鍵性作用。即便許多微生物在自然狀況下不依賴小鼠作為宿主，但是借助基因工程與人源化策略，小鼠依然可以作為重要的在體研究平臺(tái)，可用于模擬宿主與微生物互作的部分環(huán)節(jié)，從而促進(jìn)相關(guān)疾病機(jī)制的研究。

1.1 環(huán)境暴露對(duì)小鼠免疫系統(tǒng)生理與病理的影響

微生物暴露對(duì)小鼠免疫生理發(fā)育成熟發(fā)揮重要作用［14］。無菌小鼠的免疫系統(tǒng)極不成熟，但移植正常腸道菌群后可誘導(dǎo)外周免疫系統(tǒng)成熟，表現(xiàn)為外周免疫細(xì)胞類型更加豐富且數(shù)量增大。無特定病原體（specific pathogen free，SPF）小鼠的免疫系統(tǒng)類似于人類幼年階段，由于能免于常見的致病性微生物暴露，其活化的免疫細(xì)胞與記憶性淋巴細(xì)胞數(shù)量相對(duì)較少［15］。而自然界或?qū)櫸锏戢@得的小鼠（dirty∕wild mice，即臟鼠∕野生鼠）免疫活動(dòng)更接近于成年人，表現(xiàn)為組織內(nèi)免疫反應(yīng)活躍，記憶性免疫細(xì)胞顯著增多，抗體種類與豐度明顯增加［16］。將實(shí)驗(yàn)室小鼠接觸臟鼠或者后者污染的墊料，甚至將實(shí)驗(yàn)室小鼠胚胎轉(zhuǎn)移到野外捕獲的假孕雌鼠體內(nèi)，均可誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)室小鼠產(chǎn)生類似臟鼠的免疫表型［16-17］。同樣，將SPF級(jí)小鼠序貫性感染皰疹病毒、流感病毒與腸道鉤蟲后，發(fā)現(xiàn)其外周血基因表達(dá)譜與成人外周血基因表達(dá)譜十分相似［15］。新近有研究將不同基因型SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)室小鼠置于自然環(huán)境下重新野化（rewilding），發(fā)現(xiàn)環(huán)境暴露是不同個(gè)體間血液免疫細(xì)胞群變異的首要誘因，而基因型不同更容易造成個(gè)體間細(xì)胞因子產(chǎn)生差異［18］。將野外小鼠腸道菌群移植給實(shí)驗(yàn)室小鼠，可以減少炎性反應(yīng)強(qiáng)度，降低實(shí)驗(yàn)室小鼠經(jīng)流感病毒攻擊后的死亡率，降低由誘變劑氧化偶氮甲烷（azoxymethane，AOM）與致炎劑葡聚糖硫酸鈉（dextran sulphate sodium，DSS）處理誘發(fā)結(jié)直腸癌的腫瘤負(fù)荷［19］。更重要的是，研究發(fā)現(xiàn)利用臟鼠作為臨床前疫苗評(píng)估模型，相對(duì)于SPF級(jí)小鼠更接近人群對(duì)疫苗的反應(yīng)性，提示前者可能是更好的藥效評(píng)估策略［15，20］。另外，不同環(huán)境暴露還可能影響微生物與宿主免疫系統(tǒng)互作的病理表現(xiàn)。例如，有研究發(fā)現(xiàn)鼠諾如病毒感染無菌小鼠可誘導(dǎo)I型干擾素產(chǎn)生，促進(jìn)黏膜免疫成熟［21］；而感染SPF小鼠則誘導(dǎo)產(chǎn)生腫瘤壞死因子等，在炎性腸病易感小鼠模型上出現(xiàn)組織病理性改變［22］。牙齦普林單胞菌（Porphyromonas gingivalis）是牙周病主要致病菌，感染SPF級(jí)小鼠可模擬人牙周病臨床表型，而感染無菌小鼠卻未能誘導(dǎo)牙周病發(fā)生［23］。因此，利用小鼠模型研究人類生理與疾病時(shí)需要考慮環(huán)境變量對(duì)小鼠免疫表型的影響，并在此基礎(chǔ)上合理控制環(huán)境暴露以期更好地模擬人體免疫反應(yīng)，為揭示臨床相關(guān)疾病機(jī)制并探討防治策略提供高轉(zhuǎn)化價(jià)值的研究數(shù)據(jù)。

1.2 小鼠模型在腸道菌群與黏膜免疫及相關(guān)疾病研究中的應(yīng)用

現(xiàn)代小鼠與人類社會(huì)的寄生關(guān)系可追溯至約15 000年前的人類農(nóng)耕文明時(shí)期［24］。上萬年來，小鼠飲食結(jié)構(gòu)與人類食譜高度重疊，而且暴露在相似的自然環(huán)境，造成其腸黏膜內(nèi)環(huán)境與人類相似，因此小鼠模型成為研究人類腸道菌群生理與病理功能的較為理想的模式動(dòng)物。研究發(fā)現(xiàn)人類腸道菌群內(nèi)上千種不同菌種經(jīng)體外培養(yǎng)后，僅能測(cè)出約60%的種屬，而轉(zhuǎn)移至無菌鼠腸道內(nèi)定殖則可檢出約90%左右［25］，顯示小鼠模型在研究大量不可培養(yǎng)微生物構(gòu)成的復(fù)雜腸道微生態(tài)中的巨大優(yōu)勢(shì)。

利用小鼠模型研究發(fā)現(xiàn)，菌群定殖并與宿主黏膜屏障組成細(xì)胞互作對(duì)黏膜屏障功能至關(guān)重要。小鼠出生后，在其口腔、腸道中微生物序貫定殖，可誘導(dǎo)黏膜上皮細(xì)胞表達(dá)更多的細(xì)胞連接蛋白，從而促進(jìn)形成更強(qiáng)的細(xì)胞間連接，同時(shí)上調(diào)細(xì)胞因子、趨化因子等以招募免疫細(xì)胞歸巢，參與抵抗微生物侵入，逐步建立屏障功能［26-27］。黏膜上皮細(xì)胞在黏膜免疫屏障中承擔(dān)著關(guān)鍵角色［28］。上皮細(xì)胞一方面可以分泌抗菌肽、黏液以及上皮間緊密連接等區(qū)隔腔內(nèi)微生物，另一方面與固有層免疫細(xì)胞交流以調(diào)控免疫方向與活躍度。遺傳工程小鼠模型即基因修飾小鼠模型(genetic modified mouse models）在鑒定不同上皮細(xì)胞功能的研究中體現(xiàn)出重要價(jià)值。Hansson博士研究小組通過RedMUC2-98trTg轉(zhuǎn)基因小鼠模型，在體實(shí)時(shí)示蹤黏蛋白釋放，可鑒定出能響應(yīng)微生物組分并迅速釋放黏液蛋白的哨兵杯狀細(xì)胞［29］。Locksley博士研究小組通過對(duì)白細(xì)胞介素25（interleukin 25，IL-25）原位敲入紅色熒光蛋白（red fluorescent protein，RFP）基因獲得Flare25小鼠模型，發(fā)現(xiàn)組成性表達(dá)IL-25的簇細(xì)胞（Tuft細(xì)胞）是宿主感知胃腸微生物及其代謝產(chǎn)物并觸發(fā)小腸2型免疫反應(yīng)的啟動(dòng)細(xì)胞［30-31］。利用潘氏細(xì)胞溶菌酶敲除小鼠模型，研究發(fā)現(xiàn)潘氏細(xì)胞溶菌酶是腸腔溶菌酶的主要來源，溶菌酶可以調(diào)節(jié)腸道菌群組成，通過核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域（nucleotide oligomerization domain，NOD）樣信號(hào)通路影響腸道黏膜的免疫狀態(tài)。溶菌酶缺陷小鼠腸道菌群中Gram陽性菌的比例顯著上升，尤其是嗜黏液菌顯著擴(kuò)增，并激活腸道2型黏膜反應(yīng)，誘導(dǎo)杯狀細(xì)胞增生，從而分泌更多黏液蛋白，以補(bǔ)償溶菌酶缺陷造成的屏障功能下降［32］。RegⅢ是另一類腸上皮細(xì)胞分泌的抗菌多肽，敲除該基因可造成腸上皮細(xì)胞與腸腔微生物物理區(qū)隔受損，誘導(dǎo)大量的IgA+細(xì)胞和γ-干擾素陽性（interferonγ-positive，IFNγ+）Th1細(xì)胞［33］。

在黏膜特異性免疫研究中，利用小鼠模型已鑒定了大量可誘導(dǎo)特定免疫類型的微生物或微生物組合，深刻揭示了微生物在誘導(dǎo)外周免疫分化成熟中的關(guān)鍵作用。通過比較不同來源小鼠表型與腸道菌群組成差異，研究發(fā)現(xiàn)分節(jié)絲狀菌（segmented filamentous bacteria，SFB）錨定腸上皮細(xì)胞可誘生血清淀粉樣蛋白A1-3（serum amyloid A protein 1-3，SAA1-3），進(jìn)而誘導(dǎo)RORγt+T細(xì)胞表達(dá)IL-17［34-37］。另外，過表達(dá)人防御素α5（defensinα5）可以顯著抑制腸道菌群豐度，從而降低腸黏膜IL-17的表達(dá)［38］。進(jìn)一步通過比較大鼠來源與小鼠來源SFB分別對(duì)大鼠與小鼠腸道Th17細(xì)胞的誘導(dǎo)能力，發(fā)現(xiàn)微生物錨定在上皮細(xì)胞表面即可誘導(dǎo)SAA1-3表達(dá)。同樣能夠黏附腸上皮細(xì)胞的致病病原體如Citrobacter rodentium、EHEC O157：H7等均可誘導(dǎo)Th17功能。另有研究報(bào)告，利用相同策略，腸道共生菌Lactobacillus reuteri可通過色氨酸代謝衍生物激活A(yù)hR信號(hào)通路，誘生CD8αα+上皮細(xì)胞內(nèi)淋巴細(xì)胞［39］；并且證實(shí)小鼠腸道共生寄生蟲Tritrichomonas muris與腸道菌群均可通過腸上皮毛細(xì)胞激活2型腸黏膜免疫［40-41］。利用抗生素∕氯仿處理小鼠腸道菌群并監(jiān)測(cè)直腸黏膜固有層中Treg細(xì)胞的變化，鑒定并分離出ClostridiaⅣ與ⅩⅣ亞群，這些亞群具有誘導(dǎo)直腸Treg細(xì)胞的功能；進(jìn)一步借助代謝組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，這些亞群合成的短鏈脂肪酸可誘導(dǎo)直腸Treg細(xì)胞分化［42-44］。新近有研究將人腸道菌群定殖于無菌小鼠，并從具有氨芐抗性的細(xì)菌亞群中篩選到11株菌組合，這些腸道菌種組合可誘生IFNγ+CD8+T細(xì)胞，從而增強(qiáng)宿主清除細(xì)胞內(nèi)感染的能力，發(fā)揮抗腫瘤免疫作用［45］。因此，上述發(fā)現(xiàn)為探索利用相關(guān)菌株調(diào)控免疫功能，從而防治相關(guān)疾病，提供了新思路。

臨床研究發(fā)現(xiàn)許多疾病與菌群生態(tài)失調(diào)緊密相關(guān)［46］。炎性腸病是典型的由腸道菌群生態(tài)失調(diào)與易感基因攜帶宿主之間發(fā)生病理性互作所導(dǎo)致的疾病，目前研究認(rèn)為其發(fā)病原因是工業(yè)化食品加工與添加劑使用急速改變了腸道菌群生態(tài)，造成攜帶易感基因的宿主黏膜免疫系統(tǒng)病理性識(shí)別腸道菌群，誘發(fā)腸道屏障功能嚴(yán)重受損，并啟動(dòng)惡性循環(huán)［47］。通過大樣本全基因組關(guān)聯(lián)分析（GWAS），目前已鑒定出超過300個(gè)炎性腸病易感基因［48-51］。通過敲除這些基因，或采用定點(diǎn)突變技術(shù)引入炎性腸病易感的突變，構(gòu)建炎性腸病小鼠模型，可以在功能學(xué)水平上驗(yàn)證這些基因在腸黏膜免疫與炎性腸病發(fā)生過程中的作用。NOD2是首個(gè)被鑒定的炎性腸病易感基因。研究發(fā)現(xiàn)，NOD2基因敲除小鼠腸上皮細(xì)胞中杯狀細(xì)胞數(shù)量減少，細(xì)胞內(nèi)黏液蛋白分泌囊泡也減少，IFNγ+上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞水平升高，同時(shí)腸道菌群生態(tài)失調(diào)，多樣性受損，誘導(dǎo)病理性損傷條件致病菌如Bacteroides vulgatus的豐度上調(diào)；而單獨(dú)定殖B.vulgatus于甲硝唑預(yù)處理后的NOD2基因缺陷小鼠，可以再次誘導(dǎo)出相似的病理表型［52］。將炎性腸病患者的腸道菌群移植給無菌小鼠，可誘導(dǎo)更多的Th2與Th17細(xì)胞，而健康對(duì)照腸道菌群誘導(dǎo)更多的RORγt+Treg細(xì)胞；而且在腸炎模型中，前者比后者更容易誘導(dǎo)嚴(yán)重的組織損傷［53］，這揭示了生態(tài)失調(diào)的腸道菌群在炎性腸病中發(fā)揮病理生理作用。

1.3 小鼠模型在感染性疾病研究中的應(yīng)用

對(duì)于人鼠共患病原微生物，小鼠模型可以直接用于感染模型構(gòu)建。例如，鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella typhimurium）感染可造成人腹瀉、發(fā)熱等癥狀，小鼠感染亦出現(xiàn)相似表型［54］。而可造成人類傷寒熱的傷寒沙門菌（Salmonella enterica serovars typhi，S.typhi）并不能感染野生型小鼠。但是，有研究發(fā)現(xiàn)Toll樣受體Tlr11缺陷小鼠模型（Tlr11敲除小鼠模擬人類Tlr11基因缺陷）對(duì)S.typhi易感，并可出現(xiàn)人類傷寒病表型。利用滅活S.typhi疫苗免疫Tlr11缺陷小鼠，可以幫助小鼠產(chǎn)生特異性免疫，抵抗S.typhi再感染［54］。同樣，利用Ⅰ型干擾素受體（interferon-αreceptor 1，IFNAR1）缺陷小鼠也能較好地模擬寨卡病毒（Zika virus，ZIKV）感染造成的病理性損傷［55］。利用Ⅰ型與Ⅱ型干擾素受體聯(lián)合缺陷的AG129小鼠可以模擬同屬黃熱病屬的登革熱病毒感染造成的臨床表型［56］。因此，對(duì)人獸共患病原微生物研究，可以首先嘗試野生型或者天然免疫反應(yīng)缺陷型小鼠，然后通過檢測(cè)病理指標(biāo)，評(píng)估是否滿足模擬感染需求。

有些病原微生物侵入宿主時(shí)依賴人特異性感染受體，小鼠由于外顯子進(jìn)化與人的同源基因在蛋白序列上存在變異，尤其是結(jié)合位點(diǎn)突變嚴(yán)重影響小鼠與病原微生物的親和力。這種情況下，需要借助基因工程技術(shù)或人源化策略改造小鼠。比如，誘發(fā)敗血癥腦膜炎等臨床表現(xiàn)的李斯特菌（Listeria monocytogenes），經(jīng)糞口途徑感染時(shí)依賴人腸上皮E-Cadherin，其中第16位脯氨酸至關(guān)重要。小鼠由于外顯子進(jìn)化，第16位脯氨酸替換為谷氨酸，從而失去了結(jié)合內(nèi)化素（internalin）的能力。為此，有研究利用大鼠腸上皮特異性FABP啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)人E-Cadherin表達(dá)質(zhì)粒，構(gòu)建轉(zhuǎn)基因小鼠模型，誘導(dǎo)小鼠腸上皮細(xì)胞過表達(dá)人ECadherin，從而使得該小鼠對(duì)李斯特菌產(chǎn)生易感性［57］。同樣，為研究冠狀病毒SARS-CoV、COVID-19感染，構(gòu)建了K19-hACE2與mAce2-hACE2轉(zhuǎn)基因小鼠，讓冠狀病毒感染受體即人源ACE2相對(duì)特異性表達(dá)于上皮細(xì)胞或鼠內(nèi)源性mAce2表達(dá)細(xì)胞中［58-59］。這些小鼠模型一定程度上可以模擬冠狀病毒感染，病理學(xué)檢測(cè)肺等組織均可檢出病毒蛋白表達(dá)、免疫炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、組織結(jié)構(gòu)破壞等病理表型［58-59］。

有些病原微生物的宿主嗜好性體現(xiàn)在：即便提供感染受體、改變小鼠基礎(chǔ)免疫狀態(tài)，依然不能形成有效感染，推測(cè)其生活史多個(gè)環(huán)節(jié)可能依賴人源細(xì)胞或人特異性基因的參與。對(duì)于這類病原微生物感染在體研究，人源化是相對(duì)適當(dāng)?shù)牟呗浴Ｔ缙诶萌嗽赐庵苎獑魏思?xì)胞、富含CD34+造血干細(xì)胞的骨髓或胎肝人源化小鼠，可促進(jìn)對(duì)人免疫缺陷病毒、登革熱病毒、瘧原蟲等感染的研究［60-62］。對(duì)于靶向非血源性細(xì)胞的病原微生物，研究這類病原體與宿主互作可以將靶器官組織團(tuán)塊或含有靶細(xì)胞的類器官與人造血干細(xì)胞聯(lián)合移植給免疫缺陷小鼠。例如肝炎病毒感染，需要同時(shí)移植人源肝細(xì)胞［63］。新近有研究報(bào)告，在胸腺、胎肝聯(lián)合移植的基礎(chǔ)上，將人源肺組織包埋于小鼠皮下，可支持MERS-CoV、RSV、HCMV等呼吸道病毒感染，并誘導(dǎo)出一定水平的特異性細(xì)胞免疫及體液免疫［64］。

2 小鼠模型在宿主與微生物互作研究中的挑戰(zhàn)

人體與微生物互作對(duì)人類健康與疾病產(chǎn)生重要影響，但是其機(jī)制研究卻受限于倫理與技術(shù)條件，無法完整地在人體內(nèi)進(jìn)行相關(guān)研究，因此大量實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型包括各種品系的小鼠被開發(fā)出來。由于在800萬年前小鼠與人已經(jīng)分開進(jìn)化，這兩個(gè)物種對(duì)環(huán)境的刺激反應(yīng)必然帶有物種特異性［65-66］。因此，源自小鼠模型的研究發(fā)現(xiàn)是否具有轉(zhuǎn)化應(yīng)用價(jià)值，依然需要借助人源組織的多組學(xué)、大樣本研究來驗(yàn)證。另外，有些人類基因的同源基因在嚙齒類動(dòng)物基因組中已經(jīng)失活，對(duì)于這類基因參與的宿主微生物互作研究，不建議采用小鼠模型（甚至包括過表達(dá)該人類基因的轉(zhuǎn)基因小鼠）作為研究平臺(tái)。

持續(xù)暴露于多樣化組成的微生態(tài)群有助于小鼠建立類似成人的免疫反應(yīng)。但是環(huán)境暴露很難精確控制微生物的組成與比例，也很難做到實(shí)時(shí)跟蹤小鼠是否曾發(fā)生大量未知微生物感染，因此實(shí)驗(yàn)的可重復(fù)性經(jīng)常受到挑戰(zhàn)。如何標(biāo)準(zhǔn)化環(huán)境暴露因素依然有待探索，可能措施包括在多個(gè)時(shí)間點(diǎn)采集高通量數(shù)據(jù)，這無疑會(huì)明顯增加實(shí)驗(yàn)成本。另外，小鼠模型接受人腸道菌群轉(zhuǎn)移定殖，依然不能完全重現(xiàn)所有人類腸道微生物。因此，這些無法轉(zhuǎn)移的微生物造成的表型變化很難在小鼠模型上看到。最后，不少腸道菌群誘導(dǎo)的宿主表型仍然需要在易感基因攜帶者體內(nèi)才能重現(xiàn)。僅接受患者腸道菌群建立的野生型悉生小鼠（gnotobiotic mice）很可能難以重現(xiàn)類似表型，需要建立攜帶該易感基因的無菌鼠，這無疑再次增加了研究的時(shí)間成本。

在人源化小鼠構(gòu)建中，由于組織相容性抗原不同，移植物抗宿主免疫時(shí)常發(fā)生。另外，人源細(xì)胞或組織移植小鼠體內(nèi)常由于鼠源細(xì)胞因子或表面配體受體，不能滿足某些人源細(xì)胞增殖、分化、歸巢等［67］。因此，經(jīng)過篩選存活的免疫細(xì)胞與免疫反應(yīng)將出現(xiàn)偏倚，從而減弱實(shí)驗(yàn)結(jié)果的轉(zhuǎn)化價(jià)值。此外，免疫聯(lián)合缺陷小鼠由于缺乏LTi（lymphoid tissue inducer）細(xì)胞，造成二級(jí)淋巴結(jié)發(fā)育不良，人源免疫細(xì)胞很難有效利用這些淋巴組織以完成抗原特異性T或B細(xì)胞分化、增殖和成熟過程［68］。為克服上述問題，需要修飾或沉默小鼠組織相容性抗原，讓特定細(xì)胞類型表達(dá)人源分子，利用上皮特異性啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)胸腺基質(zhì)淋巴細(xì)胞生成素（thymic stromal lymphopoietin，TSLP）過表達(dá)以刺激淋巴結(jié)發(fā)育［69］等，這些也無疑增加了人源化的復(fù)雜度與成本。

3 總結(jié)與展望

3.1 利用無菌小鼠與悉生小鼠模型推進(jìn)宿主微生物互作與宿主表型之間的因果關(guān)系研究

隨著高通量測(cè)序技術(shù)不斷成熟且成本下降，微生物菌群相關(guān)研究已經(jīng)成為一個(gè)熱點(diǎn)，大量的生理病理表型與菌群的相關(guān)性被一一建立。前期大部分研究集中在描述菌群組成，驗(yàn)證其與表型的相關(guān)性，但是在更精細(xì)的菌株水平上依據(jù)科赫法則（Koch postulates）鑒定造成表型的微生物或最小微生物組合將是下一階段菌群研究的重要方向［70］。由于從未接觸任何微生物，無菌小鼠可以最大限度地排除背景微生物干擾，因此它是這類研究較理想的實(shí)驗(yàn)平臺(tái)。采集表型相關(guān)菌群，大比例稀釋后直接定殖于無菌小鼠，或者經(jīng)過體外選擇性培養(yǎng)獲得單克隆菌株，然后再定殖于無菌小鼠，從而建立悉生小鼠模型。通過比較定殖前后小鼠表型的變化，可以揭示關(guān)鍵微生物與特定表型之間的因果關(guān)系。

3.2 豐富構(gòu)建遺傳工程小鼠模型與人源化小鼠模型的技術(shù)手段

構(gòu)建攜帶類似人類易感基因突變的遺傳工程小鼠，是在體研究相關(guān)疾病的重要手段。近年來，利用成簇規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）-CRISPR相關(guān)蛋白-（CRISPR-associated protein 9，Cas9）技術(shù)顯著提高了包括同源重組在內(nèi)的基因編輯發(fā)生概率，縮短了遺傳工程小鼠模型的建構(gòu)周期［71］。基于CRISPR技術(shù)的單堿基修飾、引物編輯（prime editing）等為更精準(zhǔn)的基因編輯提供了新手段［72-74］。人源化是改造小鼠作為人與病原微生物互作研究平臺(tái)的另一種重要策略。隨著類器官3D培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展，多種人體組織塊可以被分離、重懸在富含相應(yīng)生長(zhǎng)因子的培養(yǎng)體系內(nèi)持續(xù)培養(yǎng)［75］。另外，利用誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞（induced pluripotent stem cells，iPS）持續(xù)定向誘導(dǎo)分化，亦可生長(zhǎng)出組織類器官［75］。將這些人類器官組織植入骨髓或胎肝、胸腺聯(lián)合移植的小鼠皮下或相應(yīng)臟器包膜下，可為靶向這些擬人類器官的微生物提供互作微環(huán)境。

3.3 合理利用基因組學(xué)與環(huán)境暴露建立更接近人類免疫反應(yīng)的小鼠模型

構(gòu)建更貼近人類對(duì)微生物反應(yīng)性的小鼠模型，無疑是未來遺傳工程小鼠模型研究的一個(gè)重要方向。隨著功能基因組學(xué)的發(fā)展，小鼠與人類基因表達(dá)調(diào)控的規(guī)律將會(huì)被逐漸揭示。綜合利用這些新知識(shí)，并借助合成生物學(xué)、系統(tǒng)生物學(xué)等手段，將有助于構(gòu)建更加接近人體精準(zhǔn)調(diào)控基因活動(dòng)的遺傳工程小鼠模型，并減少對(duì)基因組拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)、非靶基因表達(dá)等的干擾。利用更精準(zhǔn)的基因編輯工具，更高效地原位轉(zhuǎn)換鼠源編碼序列為人源編碼序列，從而讓小鼠獲得相同的人類疾病基因易感性或病原微生物嗜好性。另外，隨著多組學(xué)技術(shù)、大數(shù)據(jù)科學(xué)的發(fā)展，研究宿主與微生物互作的手段將會(huì)更加豐富。將這些多維數(shù)據(jù)與動(dòng)物模型在體研究緊密結(jié)合，無疑會(huì)推動(dòng)宿主與微生物互作相關(guān)研究，使人們更全面深入地認(rèn)識(shí)微生物對(duì)人類健康與疾病的影響。

[利益聲明]作者聲明本文不存在利益沖突。