乳粉中金黃色葡萄球菌測定不確定度評定

顧晟琳，夏亞文，徐 瓊

上海市質量監督檢驗技術研究院，上海 200233

0 引言

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）屬于葡萄球菌屬，是革蘭氏陽性菌，為一種常見的食源性致病微生物，可引發任何動物的中毒和感染。據2017—2019年福建省預包裝食品中致病菌污染調查結果顯示，金黃色葡萄球菌在多種食品中被廣泛檢出，包括肉制品、調味品、速凍米面等[1]。此外，乳制品也是金黃色葡萄球菌常檢出的一大類食品類別[2～4]。

目前對于金黃色葡萄球菌的檢測有諸多新技術。如利用多重聚合酶鏈式反應（Multiplex Polymerase chain Reaction，Multiplex PCR）方法，可同時檢測嬰幼兒配方奶粉中的金黃色葡萄球菌、沙門氏菌和克羅諾桿菌[5]；應用環介導等溫擴增技術可實現不同乳制品中金黃色葡萄球菌的實時監測[6]；基于流式細胞術（Flow Cytometry，FCM）可以建立快速檢測牛奶及奶粉中金黃色葡萄球菌的方法[7]；金納米粒子也可實現食源性金黃色葡萄球菌的檢測[8]。雖然上述的檢測方法比常規檢測方法更簡便、快速，但是在國際能力驗證和國內盲樣考核工作中，依然主要采用平板計數法對樣品中的金黃色葡萄球菌進行定量驗證[9，10]。

但目前已有多種因素，如稀釋液溫度[11]、試劑耗材、操作過程、儀器設備、人員及環境[12]、檢測使用的培養基[13]等均會對最終的傳統平板計數法的結果產生影響。因此對于金黃色葡萄球菌的平板計數法的不確定度研究，對于樣品中微生物數量的估算準確性具有重要的意義。本文主要參考《GB 4789.10—2016食品微生物學檢測 金黃色葡萄球菌檢驗》和《JJF 1059.1—2012測量不確定度評定與表示》，探討了乳粉中金黃色葡萄球菌計數測定不確定度評定方法，以便為評價測定結果的準確性和可靠性提供技術依據。

1 材料和方法

1.1 材料

氯化鈉（分析純），國藥集團化學試劑有限公司；Baird-Parker平板，廣東環凱微生物科技有限公司；血瓊脂平板、腦心浸出液肉湯、營養瓊脂培養基、凍干血漿，北京陸橋技術有限責任公司。

1.2 主要儀器與設備

MS6001S十分之一電子天平，梅特勒-托利多國際貿易（上海）有限公司；SMI12生化培養箱，美國SHELLAB公司；LA2-6A1-E生物安全柜，新加坡ESCO公司；SX700高壓蒸汽滅菌鍋，日本TOMY公司。

1.3 試驗方法

依據GB 4789.10—2016[14]第二法對質控樣品進行測定。主要流程簡述如下：稱取質控乳粉25.0 g，加入225 mL無菌生理鹽水中，混勻為1∶10樣品均液。對此樣品均液進行10倍梯度稀釋，每次用移液管吸取1 mL上一個稀釋度的樣品均液，注入9 mL無菌生理鹽水中，振勻，選擇其中2～3 個連續適宜稀釋度的均液進行后續加樣涂布操作。加樣時每個稀釋度的樣品勻液分別以0.3 mL、0.3 mL、0.4 mL（共計1 mL）接種3 塊Baird-Parker平板，然后均勻涂布整個平板。涂布后，將平板于生物安全柜中靜置10 min后翻轉，于（36±1）℃倒置培養24～48 h。選擇3 塊菌落總數合計在20～200 CFU之間的一個稀釋度的平板進行典型的金黃色葡萄球菌菌落計數。由一位人員對同一質控奶粉樣品進行6 次重復定量試驗。

2 結果和分析

2.1 不確定度的主要來源分析

根據GB 4789.10—2016中第二法平板計數法，分析不確定度來源有樣品的均勻性以及穩定性、取樣體積以及重復性、稀釋體積、培養時間以及溫度、測試環境的條件、人員的操作過程以及計數差異等因素，主要分析樣液制備、稀釋、加樣體積以及重復性試驗的不確定度，其他因素在此忽略。

2.1.1 樣液制備引入的不確定度（B類[15]）

檢測過程中使用的250 mL量筒、電子天平及檢測環境溫度變化的影響引入的不確定度，由檢驗證書數據計算可得。

2.1.2 稀釋引入的不確定度（B類）

檢測過程中使用的1 mL和10 mL刻度移液管及檢測環境溫度變化的影響引入的不確定度，由檢驗證書數據計算可得。

2.1.3 加樣體積引入的不確定度（B類）

檢測過程中使用的1 mL刻度移液管及檢測環境溫度變化的影響引入的不確定度，由檢驗證書數據計算可得。

2.1.4 重復性試驗引入的不確定度（A類）

主要是由樣品的重復測定造成的結果波動所引入。

2.2 數學模型

依據GB 4789.10—2016中第二法，檢測金黃色葡萄球菌菌落數T值為式（1）

T-樣品中金黃色葡萄球菌菌落數；

A-某一稀釋度典型菌落的總數；

B-某一稀釋度血漿凝固酶陽性的菌落數；

C-某一稀釋度用于血漿凝固酶試驗的菌落數；

d-稀釋因子。

2.3 測量不確定度計算

2.3.1 樣液制備引起的不確定度Urel（制備）

（1）電子天平稱量值m稱的不確定度

在稱量25 g樣品，制備樣品勻液時使用電子天平引入的不確定度，來源為：①天平示值誤差：由檢定證書給出的允差為±0.5 g，按均勻分布考慮，②重復性：由檢定證書給出的允差為±0.5g，按均勻分布考慮，因此，

（2）250 mL量筒體積V量的不確定度

在量取225 mL生理鹽水，制備樣品勻液時使用量筒引入的不確定度，來源為：①體積：由檢定證書給出的允差為±0.25 mL，按均勻分布考慮：②溫度：溫度變化的范圍為±4 ℃，按均勻分布考慮：

（3）合成Urel（制備）

2.3.2 連續稀釋引起的不確定度Urel（稀釋）

在對樣品勻液進行梯度稀釋時，一般是用無菌吸管吸取上級樣品均液1 mL，注入9 mL無菌生理鹽水的試管中，因此對于連續稀釋引起的不確定度Urel（稀釋）主要涉及1.0 mL刻度移液管體積V1和10 mL刻度移液管體積V2兩個方面。

（1）1.0 mL刻度移液管體積V1的不確定度

①體積：檢定證書提供的數值（1±0.01 mL）；

②溫度：溫度變化的范圍為±4 ℃；

近似于矩形分布

由1.0 mL刻度移液管體積V1引入的相對不確定度為：

（2）10 mL刻度移液管體積V2的不確定度

①體積：由檢定證書給出的允差為±0.014 mL；

按均勻分布考慮：

由10 mL刻度移液管體積V2引入的相對不確定度為

（3） 一次稀釋產生的相對不確定度Urel（一次稀釋），運用泊松關于微生物培養產生的不確定度定量測定理論中的公式進行計算：

2.3.3 加樣體積引入的不確定度Urel（加樣）

加樣時使用1 mL刻度移液管以0.3 mL、0.3 mL、0.4 mL接種3 塊Baird-Parker平板，1 mL刻度移液管均用了3 次，主要包括2 次移取0.3 mL樣品稀釋液和1 次0.4 mL樣品稀釋液，引入的不確定度主要涉及1.0 mL刻度移液管體積的U（V1）。則加樣時相對標準不確定度為：

表1 同一質控樣品6 次計數結果和計算值

2.3.4 同一樣品重復性試驗引起的不確定度評定Urel（R）

由一位檢驗人員對同一質控樣品進行6 次重復計數實驗，計數結果和計算值見表l。對6 次計數結果取對數，并對對數值進行均值和殘差的計算，然后代入貝塞爾公式計算得出計數結果對數值標準偏差的合成樣本標準差。

由于每個樣品重復測定6 次，總體合成不確定度：

2.3.5 金黃色葡萄球菌平板計數的合成不確定度Urel和擴展不確定度U

本次試驗重復6 次，則自由度V=n-1=5，選擇置信水平P=95%，根據t分布可知：k=t 95（5）=2.571

因此，擴展不確定度為：

2.3.6 結果報告

由于本次試驗將檢測結果取對數后進行不確定度計算，因此擴展不確定度針對的是測量結果的對數值，是以當檢測結果以對數值的形式表示時，測試結果對數值的平均值為5.43，取值區間為5.43±0.108，即5.32～5.54；測試結果則以對數值的取值再取反對數所得，其取值區間為2.1×105～3.5×105CFU/g之間。

3 結論

本試驗按照GB 4789.10—2016中第二法平板計數法的操作規程進行試驗，探究的不確定度來源主要是樣液制備、稀釋、加樣體積3 個B類不確定度以及重復性試驗1 個A類不確定度。其中，重復性試驗由1 位檢驗人員對同1 份奶粉質控樣品進行6 次重復試驗，主要探究對于1 份奶粉樣品的檢測結果的準確性。由于此次金黃色葡萄球菌重復性檢測結果具有較大的偏離，不適合直接按照貝塞爾公式計算，因此本試驗在金黃色葡萄球菌計數的測量中采用取對數的方法對不確定度進行評定[16]。

經結果發現，由同1 位檢驗人員獨立操作整個金黃色葡萄球菌檢驗過程時，其加樣體積引入的不確定度較大，其次是重復性試驗。因此，在試驗時，尤其在日常的檢測過程中，樣品的測定必須嚴格控制試驗條件，提高檢驗人員操作技能。此外還應多做平行試樣，以確保實驗數據的準確性。同時也確認了本研究建立的方法對于這類檢驗條件下金黃色葡萄球菌不確定的評定可行性。