牛奶中不同酪蛋白遺傳變異體及其分型鑒定研究

譚蓮英，夏忠悅，錢成林，董成虎，宋艷梅，范光彩

1 新希望乳業(yè)股份有限公司，四川成都 610011

2 乳品營養(yǎng)與功能四川省重點實驗室，四川成都 611730

3 夏忠悅勞模和工匠人才創(chuàng)新工作室，四川成都 611730

0 引言

在世界上已知的各種食物里，牛奶是大自然賜予人類最接近完美的食物，被譽為“白色血液”。牛奶中存在的蛋白質(zhì)主要有酪蛋白和乳清蛋白兩大類，酪蛋白主要分αs1-酪蛋白、αs2-酪蛋白、β-酪蛋白、κ-酪蛋白；乳清蛋白主要分為β-乳球蛋白、α-乳白蛋白、血清白蛋白和免疫球蛋白及其他微量蛋白[1]。奶牛存在不同酪蛋白遺傳變異體，根據(jù)牛奶中酪蛋白的特定氨基酸位置來確定每一種亞型，不同酪蛋白在消化過程中會產(chǎn)生不同的生物活性產(chǎn)物，對人體具有不同的生理功能。本文研究了不同酪蛋白亞型的比例及其功效、基因分型鑒定方法和實際應(yīng)用，以區(qū)分不同牧場牛群的遺傳變異體類型和比例，指導(dǎo)牧場快速分群飼養(yǎng)奶牛，分別生產(chǎn)不同類型的生乳，加工高品質(zhì)乳制品。

1 牛奶中主要酪蛋白遺傳變異體基因分型及其功效

牛奶酪蛋白主要分αs酪蛋白（包含αs1-酪蛋白和αs2-酪蛋白）、β-酪蛋白、κ-酪蛋白，四者的比例約為40∶10∶35∶12，該比例會影響酪蛋白膠束的穩(wěn)定性。

αs1-酪蛋白是牛奶中最常見的酪蛋白形式，已被報道具有抗氧化和自由基清除作用，還與酪蛋白從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)向高爾基體的轉(zhuǎn)運有關(guān)。

αs2-酪蛋白的蛋白水解片段已被證明具有抗菌活性。特別是39氨基酸殺細(xì)胞粒體-1（Casocidin-1）肽段已被證明能夠抑制大腸桿菌（E. coli）和葡萄球菌（Staph.carnosis）的生長。

在牛奶凝結(jié)過程中，κ-酪蛋白被凝乳酶水解可釋放水溶性片段，副κ-酪蛋白和疏水性酪蛋白巨肽。其中的酪新素A、B和C具有阿片拮抗活性，酪新素C可結(jié)合補體C3a受體[1]。

1.1 牛奶中β-酪蛋白遺傳變異體基因分型及其功效

β-酪蛋白及其片段已被證明具有多種功效，已被報道能夠激活巨噬細(xì)胞的吞噬作用和過氧化物釋放。β-酪蛋白也是一種酪啡肽來源，酪啡肽可能是二肽基肽酶IV的水解產(chǎn)物，具有阿片樣活性，可結(jié)合阿片受體[2]。

β-酪蛋白在酪蛋白中含量第二，占總酪蛋白的35%。因為編碼這些蛋白的基因在不同的牛里面是不一樣的，所以β-酪蛋白有7 種不同的形式，最常見的兩種是A1β-酪蛋白和A2β-酪蛋白。只含有A2 β-酪蛋白而不含有A1β-酪蛋白的牛奶為A2牛奶。含純A2β-酪蛋白的A2牛奶可幫助改善人類攝入某些乳制品后的消化道不適癥狀。一項隨機、雙盲、交叉試驗中，45 名自述有乳糖不耐受癥狀的受試者分別攝入僅含A2β-酪蛋白和含有A1、A2兩種類型β-酪蛋白的牛奶，經(jīng)過14 天治療期及14 天基線期和治療期之間的洗脫期，再通過膠囊內(nèi)鏡檢測胃腸功能、進行精細(xì)認(rèn)知障礙測試（SCIT）等，結(jié)果顯示，與僅含A2 β-酪蛋白的牛奶相比，攝入同時含2 種類型β-酪蛋白的牛奶可以導(dǎo)致炎癥相關(guān)生化指標(biāo)和β酪啡肽水平升高、胃腸道通過時間延長、短鏈脂肪酸水平降低、SCIT反應(yīng)時間延長及錯誤率增加[3]。相反，攝入僅含A2β-酪蛋白牛奶者癥狀則未加重。通過動物試驗比較了A1β-酪蛋白和A2β-酪蛋白對腸胃產(chǎn)生的作用。與含A2β-酪蛋白的牛奶相比，給嚙齒類動物喂飼含A1β-酪蛋白的牛奶可明顯延遲胃腸傳輸時間[4]，使消化道產(chǎn)生不適癥狀。此外，給小鼠的無奶基礎(chǔ)飲食中添加A1β-酪蛋白后，小鼠腸道炎癥標(biāo)志物明顯增多，而添加A2β-酪蛋白的基礎(chǔ)飲食對小鼠則未產(chǎn)生作用[5]。

1.2 牛奶中κ-酪蛋白遺傳變異體基因分型及其功效

κ-酪蛋白是牛乳中酪蛋白的組成之一，在牛脫脂乳中約占總酪蛋白的13%。κ-酪蛋白是使牛奶保持穩(wěn)定的乳濁液態(tài)的重要因子，不僅在酪蛋白微團的穩(wěn)定性方面起到至關(guān)重要的作用，且對奶牛泌乳性能及乳成分組成和奶酪品質(zhì)均有一定程度的影響[6]。

與αs-酪蛋白和β-酪蛋白不同，κ-酪蛋白在N-和C-末端有兩個帶電區(qū)段，這一結(jié)構(gòu)差別決定其功能特點。

κ-酪蛋白具有A、B兩種不同的變異體（A型和B型），κ-酪蛋白中κ-CN A和κ-CN B的結(jié)構(gòu)差異是第148位和136位氨基酸類型不一致。κ-CN A第148位為Asp（天冬氨酸），第136位為Thr（蘇氨酸），κ-CN B第148位為Ala（丙氨酸），第136位為Ile（異亮氨酸）。

用攜帶κ-酪蛋白B型基因的奶牛產(chǎn)的牛乳比κ-酪蛋白A型生產(chǎn)的奶酪產(chǎn)量更高、凝乳更快、硬度更適中[6]。

κ-酪蛋白的水解產(chǎn)物具有抗凝血酶原肽、免疫刺激肽、酪蛋白阿片肽等物質(zhì)，均具有生理活性功能[6]。

由于不同β-酪蛋白、κ-酪蛋白遺傳變異體基因構(gòu)型牛奶有不同的生理活性，且目前的鑒定方法較復(fù)雜，有必要研究簡單易行可推廣應(yīng)用的鑒定方法。

2 牛奶中不同遺傳變異體酪蛋白分型檢測鑒定方法

2.1 基因鑒定

目前常用的基因鑒定方法有：等位基因特異PCR法（AS-PCR）、創(chuàng)造酶切位點PCR法（ACRSPCR）、單鏈構(gòu)象多態(tài)性PCR法（SSCP-PCR）、Taq Man等方法，可通過奶牛族譜、基因DNA測序等基因檢測技術(shù)來鑒定不同酪蛋白遺傳變異體奶牛基因。

通過基因鑒定篩選區(qū)分?jǐn)y帶不同遺傳變異體基因型β-酪蛋白和κ-酪蛋白奶牛，準(zhǔn)確度能達(dá)到99%以上，適宜直接鑒定奶牛基因型，但基因鑒定無法直接鑒定乳及其制品的蛋白質(zhì)類型。

2.2 毛細(xì)管電泳儀分離檢測

毛細(xì)管電泳儀和SDS-MW Protein Analysis kit分離檢測乳及其制品中乳清蛋白及酪蛋白類型，利用動態(tài)涂層毛細(xì)管將乳清蛋白和不同遺傳變異體構(gòu)型的蛋白質(zhì)分離，紫外或二極管陣列檢測器檢測A1-β酪蛋白、A2-β酪蛋白。確定牛奶是否為某一純的β-酪蛋白或是混合型[7，8]。

2.3 高效液相色譜儀分離檢測

高效液相色譜法分離檢測乳及其制品中酪蛋白類型，利用反相高效液相色譜梯度洗脫，根據(jù)不同遺傳變異體酪蛋白保留時間和峰面積確定樣品中酪蛋白的類型和含量。

2.3.1 試驗過程

常用設(shè)備：高效液相色譜儀（帶自動進樣器，UV或二極管陣列檢測器）、離心機（離心力大于1 0000 r/min）、色譜柱（型號：ZORBAX 300ABond 300SBC8；規(guī)格：250 mm×4.6 mm，3.5 μm）、渦旋儀等。

主要試劑：TFA、鹽酸胍、雙（2-羥乙基）氨基-三（羥甲基）甲烷和、磷酸氫二鈉、β-巰基乙醇、乙腈。

檢測條件：波長：214 nm；流動相A：0.1% TFA水溶液；流動相B：0.1% TFA乙腈溶液；進樣量：50 μL；色譜柱溫度：40 ℃。

表1 梯度洗脫程序

生乳或乳制品樣品預(yù)冷至2～4 ℃，再經(jīng)10 000 r/min離心力冷凍離心大于10 min，棄去上面脂肪層；取中間清液1 mL于10 mL離心管中，加入5 mL緩沖溶液（5 mol/L鹽酸胍、0.08 mol/L雙（2-羥乙基）氨基-三（羥甲基）甲烷、5 mmol/L磷酸氫二鈉的混合水溶液），混勻，室溫下靜置反應(yīng)2 h；將樣品渦旋混勻，在 1 2000 r/min離心力作用下離心10 min；取下層液體1 mL，加入990μL 5 mol/L鹽酸胍水溶液，10 μL 10%β-巰基乙醇水溶液，混勻，離心，將離心后液體用0.22 μm水系微孔濾膜過濾于樣品瓶中，待測樣品用于高效液相色譜儀檢測。標(biāo)準(zhǔn)品用相同的方式處理后上機測定（圖1）。

圖1 高效液相色譜儀分離A1、A2β-酪蛋白圖譜

2.3.2 試驗結(jié)果與分析

標(biāo)準(zhǔn)品在0.2～3 mg/mL濃度范圍內(nèi)，A2-β-酪蛋白濃度與峰面積呈正相關(guān)，線性回歸方程為y=4.14e-5x-0.00024，其中y為A2-β-酪蛋白濃度，x為峰面積；線性相關(guān)系數(shù)為r=0.9956，符合GB/T 27417—2017中對于準(zhǔn)確定量方法，線性回歸方程的相關(guān)系數(shù)不低于0.99的要求[9]。

選取不同生乳、滅菌乳、巴氏殺菌乳樣品前處理后，平行測定6 次，得到生乳相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.81%～2.40%，巴氏殺菌乳相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.78%～1.33%，滅菌乳相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.19%～1.09%（表2），符合GB/T 27417—2017中當(dāng)被測組分含量在1%時，試驗室內(nèi)變異系數(shù)小于2.7%的要求[9]。

表2 方法精密度試驗結(jié)果

分別選取生乳、巴氏殺菌乳和滅菌乳基質(zhì)添加不同濃度的A2-β-酪蛋白進行三水平六平行加標(biāo)回收試驗。生乳分別添加2.60 mg/mL、5.44 mg/mL、10.80 mg/mL，每個濃度分別測定6 次，得到回收率范圍為92.5%～105.2%；滅菌乳分別添加2.40 mg/mL、4.80 mg/mL、9.60 mg/mL三個濃度水平，分別測定6 次，得到回收率范圍為94.2%～104.0%；巴氏殺菌乳分別添加2.40 mg/mL、4.80 mg/mL、9.60 mg/mL，每個濃度分別測定6 次，得到回收率范圍為94.6%～102.8%（表3）。

表3 不同基質(zhì)加標(biāo)回收率

采用高效液相色譜法分離檢測100 份不同牧場單個牛體生乳樣本，通過試驗分離發(fā)現(xiàn)不同牛體所含有的酪蛋白類型不同，其中部分牛體只含有單一的κ-酪蛋白、β-酪蛋白，混合型牛體占比較高，其中混合型κ-酪蛋白（同時含κ-CN A和κ-CN B）占比為50%～60%，混合型β-酪蛋白（同時含β-CN A1和β-CN A2）占比為60%～70%（圖2）。

圖2 不同牛乳樣本中酪蛋白類型占比

3 結(jié)論

不同β-酪蛋白、κ-酪蛋白變異體基因構(gòu)型牛奶有不同的生理活性功能，有必要對其進行分型鑒定。

β-酪蛋白、κ-酪蛋白遺傳變異體基因亞型牛奶的鑒定方法多樣，本文對比了不同的鑒定方法，重點通過試驗對高效液相色譜分離鑒定方法進行驗證，方法精密度和回收率均滿足要求，且能有效分離不同κ-酪蛋白和β-酪蛋白。通過對牧場不同牛乳樣本進行分型鑒定發(fā)現(xiàn)，同時具有κ-酪蛋白A型和B型基因型的牛乳占比在50%以上，單一κ-酪蛋白A型牛乳、κ-酪蛋白B型牛乳占比分別在30%～40%、10%～15%。其中A2β-酪蛋白牛奶占比為25%～35%。研究發(fā)現(xiàn)高效液相色譜分離鑒定方法既可用于奶牛的分型鑒定，又可用于生牛乳及其生產(chǎn)的乳制品的酪蛋白類型鑒定，可以幫助生產(chǎn)企業(yè)開發(fā)不同類型的乳制品。