甜菜紅素的提取優化及穩定性研究

何敏，苗僑偉，劉偉，劉軍海

(1.陜西理工大學 化學與環境科學學院，陜西 漢中 723000；2.陜西理工大學陜西省催化基礎與應用重點實驗室，陜西 漢中 723000)

紅甜菜是藜科甜菜屬的變種[1]，也稱火焰菜、紫菜頭[2-3]。紅甜菜富含糖類、維生素等，內含多種微量元素和大量甜菜苷，營養成分豐富，醫用價值高，是世衛組織確定的最佳蔬菜之一[4]。甜菜紅素[5-6]是一種水溶性天然色素[7-8]，色澤鮮艷、著色性好，在甜菜色素中含量高達90%。甜菜紅素具有較好的抗氧化能力，可作為保健品、藥品和食品添加劑。目前甜菜紅素的提取工藝收率較低，對其穩定性的研究較少[9-11]，因此，對甜菜紅素提取優化和穩定性的研究很有必要[12-13]。常用的提取方法有超聲輔助提取法、溶劑提取法、微波輔助提取法等，超聲輔助提取技術具有提取效率高、節能環保等優勢，在提取生物活性物質方面應用廣泛[14-15]。本研究以紅甜菜為原料，采用超聲輔助提取甜菜紅素，在單因素試驗的基礎上進行正交試驗，進一步探究甜菜紅素的穩定性，為提取甜菜紅素及其在食品添加劑中的應用提供了參考。

1 材料與方法

1.1 原料、試劑與儀器

新鮮甜菜：市售；無水乙醇、乙醚、鹽酸、丙酮、氫氧化鈉、山梨酸鉀、苯甲酸鈉、氯化鐵、硫酸鎂、硫酸鋅、氯化鈣、硫酸銅、硫酸鉛：均為分析純。

BSA224S-CW型分析天平 賽多利斯科學儀器(北京)有限公司；BCD-218ZM2D型冰箱 合肥美菱股份有限公司；H1850型低速離心機 北京京立離心機有限公司；DF-101S型恒溫水浴鍋 鄭州長城科工貿有限公司；MT-5000型pH計 上海亞榮生化儀器廠；GW1030型超聲波清洗機 深圳市潔盟清洗設備有限公司；WGLL-230BE型電熱鼓風干燥箱 天津市泰斯特儀器有限公司；Cary 50型紫外分光光度計 上海儀電分析儀器有限公司。

1.2 甜菜紅素的提取及測定

1.2.1 原料預處理

將新鮮紅甜菜洗凈，放入干燥箱中除去表面水分，將干燥好的甜菜切絲備用。

1.2.2 甜菜紅素的提取及測定

稱取1.0 g 甜菜絲，加入50 mL的蒸餾水進行浸泡，用保鮮膜密封后，設置超聲波清洗機溫度為40 ℃，提取40 min后，將提取液放入離心機中以3 000 r/min 離心10 min，抽濾得到甜菜紅素提取液。

取25 mL甜菜紅素提取液稀釋于50 mL容量瓶中，加蒸餾水至刻度線并充分搖勻，將所得溶液在200～800 nm波長處掃描，確定最大吸收波長。

1.2.3 甜菜紅素提取的單因素試驗

在1.2.2提取試驗的基礎上，分別改變料液比、提取溫度、提取時間、提取pH進行單因素試驗設計，考察各因素對甜菜紅素提取的影響。參數考察范圍分別為料液比1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6 (g/mL)；提取溫度20，30，40，50，60 ℃；提取時間20，30，40，50，60 min；提取pH 2，3，4，5，6，每組平行提取3次。

1.2.4 甜菜紅素提取的正交試驗

以單因素試驗為基礎，選取料液比、提取時間、pH、提取溫度4個因素進行L9(34)正交試驗優化甜菜紅素的提取條件，以甜菜紅素最大吸收波長535 nm處的吸光度為指標，優化甜菜紅素提取條件。正交試驗因素水平設計表見表1。

表1 正交試驗因素水平設計表Table 1 Design of factors and levels of orthogonal test

1.3 甜菜紅素的穩定性研究

以單因素試驗及正交試驗所得最優提取條件提取甜菜紅素，取5 mL提取液加入50 mL容量瓶中，加入蒸餾水定容，取稀釋液5 mL置于5個25 mL的具塞刻度試管中，待用。

分別考察溫度、光照、金屬離子、防腐劑對甜菜紅素穩定性的影響。參數考察范圍分別為溫度20，40，60，80，100 ℃；光照 2，8，24，48，120 h；金屬離子Fe3+、Cu2+、Ca2+、Zn2+、Mg2+、Pb2+0.01 g/mL；防腐劑1%苯甲酸鈉、1%山梨酸鉀、對照組。

2 結果與分析

2.1 甜菜紅素浸提劑的選擇與最大吸收波長的確定

甜菜紅素在不同提取溶劑下的溶解性見表2。

表2 甜菜紅素在不同提取劑下的顏色及溶解性Table 2 Color and solubility of betacyanin under different extractants

由表2可知，甜菜紅素在蒸餾水中提取液為紅色，溶解性最強，吸光度值為 0.783 5；微溶于乙醇，提取液呈淡紅色，不溶于無水乙醇、乙醚和丙酮；在乙醚中提取液為黑紫色，可能是乙醚促進了色素氧化。用蒸餾水作提取溶劑時，甜菜紅素在535 nm處出現最大吸光度值，故選用蒸餾水為最佳提取劑。

2.2 單因素試驗分析

2.2.1 料液比對甜菜紅素提取的影響

以蒸餾水為提取劑，在不同料液比條件下，對提取的甜菜紅素溶液的吸光度進行測定，結果見圖1。

圖1 料液比對甜菜紅素提取的影響Fig.1 Effect of solid-liquid ratio on the extraction of betacyanin

由圖1可知，隨著料液比的增大，甜菜紅素的提取效率逐漸增大，吸光度值在達到最大后開始減小，當料液比達到1∶5 (g/mL)時，吸光度值達到最大，隨后吸光度值減小，這可能是由于甜菜中的甜菜紅素是有限的，繼續增加料液比，多余的提取劑稀釋了提取液，因此吸光度小幅度降低。綜上，選擇料液比為1∶5 (g/mL)更合適。

2.2.2 提取溫度對甜菜紅素提取的影響

不同溫度下甜菜紅素的提取結果見圖2。

圖2 提取溫度對甜菜紅素提取的影響Fig.2 Effect of extraction temperature on the extraction of betacyanin

由圖2可知，溫度升高，甜菜紅素的吸光度增大，在30 ℃時達到最大值。超過30 ℃時，色素逐漸分解，吸光度值下降，由此可見溫度對甜菜紅素提取的影響較大。甜菜紅素易氧化、耐熱性差，所以在生產中甜菜紅素的提取溫度控制在30 ℃左右為宜。

2.2.3 提取時間對甜菜紅素提取的影響

不同提取時間下甜菜紅素的提取結果見圖3。

圖3 提取時間對甜菜紅素提取的影響Fig.3 Effect of extraction time on the extraction of betacyanin

由圖3可知，隨著提取時間的延長，吸光度不斷增大，但在40 min后甜菜紅素的吸光度變化不大，可能是提取過程已經達到動態平衡。其次，在40 min后延長提取時間，甜菜紅素的吸光度變化不是很大，從經濟成本和時間效率上考慮，提取時間為40 min較合適。

2.2.4 pH對甜菜紅素提取的影響

不同pH下甜菜紅素的提取結果見圖4。

圖4 pH對甜菜紅素提取的影響Fig.4 Effect of pH on the extraction of betacyanin

由圖4可知，提取溶劑的pH增大，甜菜紅素的吸光度增大，在pH為4時達到最大值，pH大于4后，吸光度開始減小，呈先增大后減小的趨勢，原因可能是pH的增大破壞了色素結構，導致吸光度減小，故選擇pH 4為較佳的酸度。

2.3 正交試驗結果分析

在單因素試驗的基礎上，選用料液比(A)、提取時間(B)、pH(C)、提取溫度(D)4個因素進行正交試驗，結果見表3。

表3 正交試驗結果Table 3 Results of orthogonal test

由表3中極差R分析結果可知，影響甜菜紅素提取效果的4個因素由大到小為C>A>B>D，即pH對甜菜紅素提取效果的影響最大，其次為料液比。甜菜紅素的最佳提取條件為A2B2C2D2，即料液比為1∶5 (g/mL)，提取pH為4，提取溫度為30 ℃，提取時間為40 min。

驗證試驗：利用單因素試驗和正交試驗優化后的條件提取甜菜紅素，平行3組試驗，測定吸光度，取平均值，得到最大吸光度為0.836 4，說明正交試驗優化得到的提取條件是可行的。

2.4 甜菜紅素穩定性結果分析

2.4.1 溫度對甜菜紅素穩定性的影響

在波長535 nm處對處理過的甜菜紅素提取液進行吸光度測定，結果見圖5。

圖5 溫度對甜菜紅素穩定性的影響Fig.5 Effect of temperature on the stability of betacyanin

由圖5可知，溫度對甜菜紅素穩定性的影響較大，隨著溫度的升高，吸光度減小，當溫度上升到40 ℃后，甜菜紅素的吸光度下降速度加快，可能是溫度過高破壞了甜菜紅素的結構，說明甜菜紅素的熱穩定性較差，其儲存環境的溫度應低于40 ℃。

2.4.2 光照對甜菜紅素穩定性的影響

在波長535 nm處對處理過的甜菜紅素提取液進吸光度測定，結果見圖6。

圖6 光照對甜菜紅素穩定性的影響Fig.6 Effect of light on the stability of betacyanin

由圖6可知，在避光條件下，甜菜紅素的吸光度值變化并不是很大；而在日光條件下照射后，甜菜紅素的吸光度值隨著時間的推移有明顯的下降趨勢，并且兩條折線之間的距離也在變大，說明光照對甜菜紅素穩定性有明顯的影響，這可能是隨著光照時間的增加，甜菜紅素發生了氧化變質，導致吸光度下降。

2.4.3 金屬離子對甜菜紅素穩定性的影響

對甜菜紅素在生產加工過程中常使用的儀器設備及溶液進行理化分析，選用Fe3+、Cu2+、Zn2+、Pb2+、Mg2+、Ca2+6種金屬離子作為考察參數。在波長535 nm處對加入各金屬離子的甜菜紅素溶液進行吸光度測定，試驗結果見表4。

表4 金屬離子對甜菜紅素穩定性的影響Table 4 Effect of metal ions on the stability of betacyanin

由表4可知，各金屬離子對甜菜紅素色澤無明顯影響；Ca2+對甜菜紅素穩定性的影響較小；Fe3+和Cu2+對甜菜紅素穩定性的影響較大，所以甜菜紅素應盡量避免與Fe3+和Cu2+接觸。

2.4.4 防腐劑對甜菜紅素穩定性的影響

在波長535 nm處對甜菜紅素在不同防腐劑下的吸光值進行測定，結果見圖7。

圖7 防腐劑對甜菜紅素穩定性的影響Fig.7 Effect of preservatives on the stability of betacyanin

由圖7可知，苯甲酸鈉和山梨酸鉀均對甜菜紅素的穩定性有一定影響，尤其是添加1%苯甲酸鈉溶液對甜菜紅素的穩定性有明顯加強作用。因此，在甜菜產品生產時可以添加1%苯甲酸鈉作為防腐劑。

3 結論

以紅甜菜為原料，采用超聲輔助提取技術，通過單因素試驗和正交試驗確定了甜菜紅素的最佳提取條件。結果表明甜菜紅素提取的最佳條件為料液比1∶5 (g/mL)、提取pH 4、提取溫度30 ℃、提取時間40 min。在此條件下，甜菜紅素的最大吸光度可達到0.836 4，表明提取效果較佳。

甜菜紅素穩定性試驗表明，溫度超過40 ℃時，甜菜紅素的吸光度明顯下降；光照對甜菜紅素吸光度的影響明顯大于避光條件；Fe3+和Cu2+對甜菜紅素吸光度的影響較大；山梨酸鉀對甜菜紅素吸光度的影響小于苯甲酸鈉。因此，甜菜紅素應在40 ℃以下避光保存，避免與Fe3+和Cu2+接觸，可與苯甲酸鈉作為食品添加劑共同使用。綜上所述，采用超聲輔助提取的甜菜紅素提取率高、穩定性較好。研究結果可為甜菜紅素的提取及在食品、藥品添加劑方面的應用提供參考。