16SrRNA高通量測序研究持續性高危型HPV感染患者陰道菌群特征

林妙東 周 潔 馬占忠 何劍芬 莊曉丹 朱慧樂 劉 貞 胡紅波粵北人民醫院，廣東韶關 512026

宮頸癌（cervical cancer，CC）是女性第四大常見癌癥，全世界每年新發病例超過500 000例，新增死亡病例約311 000例[1]。持續性的人乳頭瘤病毒（human papillonavirvs，HPV）感染在CC和宮頸上皮內瘤變（cervical intraepithelial neoplasia，CIN）的發病機制中起重要作用[2-3]。盡管持續性的宮頸HPV感染是宮頸癌前病變和CC發生的一個重要原因，但HPV的清除、持續感染與宮頸發生癌前病變并進展到癌變這一過程的驅動和協同致病因素還知之甚少。因此，研究協同或抑制從HPV感染向宮頸癌前病變和宮頸癌變發展的其他相關因素是至關重要的。越來越多的證據表明，陰道微生物群是這種轉變的關鍵因素。本研究基于Illumina高通量測序平臺和BIPES序列研究方法，檢測分析持續性HR-HPV感染者陰道菌群的特征，為揭示HR-HPV持續感染及其引起宮頸病變的機制提供線索和理論依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2020年6月至2021年7月在粵北人民醫院（我院）婦科門診就診的女性，1年內曾接受兩次HPV檢查，且間隔時間超過6個月。將兩次檢測到相同亞型的HR-HPV納入持續HPV陽性組，共36例。兩次檢測HR-HPV均陰性者納入持續HPV陰性，共10例。納入標準：21～75歲女性；取樣前3 d內無性接觸和陰道給藥；1個月內未系統性使用抗生素或抗真菌藥。排除標準：妊娠期和產褥期女性；免疫缺陷疾病的女性。本研究已通過粵北人民醫院醫學倫理委員會批準（KY-2020-011）。全部入組患者已經簽署知情同意書。

1.2 分組

1.2.1 按HR-HPV型別分組 HR-HPV陰性組有10例，年齡43～46歲，中位年齡43歲；單一HRHPV陽性組有22例，年齡44～52歲，中位年齡48歲；多重HR-HPV陽性組有14例，年齡38～51歲，中位年齡46歲。三組間年齡比較，差異無統計學意義（P＞ 0.05）。

1.2.2 按宮頸病變程度分組 HR-HPV陽性組中共有23例接受宮頸活檢，其中慢性炎癥組7例，年齡30～45歲，中位年齡39歲；低級別鱗狀上皮內病變（LSIL）組6例，年齡35～49歲，中位年齡42歲；高級別鱗狀上皮內病變（HSIL）組10例，年齡31～59歲，中位年齡43歲。三組年齡比較，差異無統計學意義（P＞ 0.05）。

1.3 方法

1.3.1 陰道菌群檢測 ①樣本采集：受試者需要在月經干凈后采樣，并在取樣前3 d禁止性生活及陰道局部用藥，用兩個無菌陰道棉簽收集陰道穹窿或陰道中側的分泌物，之后立即置于-80℃冰箱保存；②16SrRNA高通量測序：陰道菌群基因組提取、16SrRNA-V4區域基因片段的擴增、16SrRNA-V4區域基因高通量測序、生物信息學分析均外送至華大基因（武漢）完成。

1.3.2 HPV基因分型檢測 采用PCR-反向點雜交技術對宮頸脫落細胞標本進行14種高危型HPV基因分型檢測。

1.3.3 病理 對病變可疑的部位行宮頸活檢術和/或宮頸管搔刮術。組織標本由兩名以上的資深病理學專家分別進行病理診斷，診斷依據為2020年美國國立綜合癌癥網絡（National comprehensive cancer network，NCCN）宮頸癌臨床實踐指南[4-5]。

1.4 統計學方法

采用SPSS 26.0統計學軟件分析數據，計量資料不符合正態分布以中位數[M（P25，P75）]表示，采用非參數檢驗的秩和檢驗，兩組間比較采用曼-惠特尼（Man-whttey）檢驗（Z值），多組間采用Kruskal Wallis（H值）秩和檢驗，P＜ 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同HR-HPV感染型別亞組間陰道菌群分析

圖1A，β多樣性分析顯示HR-HPV陰性組、單一HR-HPV陽性組、多重HR-HPV陽性組的陰道菌群結構比較，差異有統計學意義（H=12.872，P＜ 0.001）；圖1B顯示在HR-HPV陽性亞組中，單一HR-HPV陽性組和多重HR-HPV陽性組的陰道菌群結構比較，差異有統計學意義（Z=3.214，P＜ 0.001）。圖1C關鍵物種分析，在屬水平上，Lactobacillus菌屬、Prevotella菌屬、Anaerococcus菌屬和Dialister菌屬的占比存在差異，Lactobacillus菌屬在多重HR-HPV陽性組出現了明顯的豐度下調，差異有統計學意義（Z=4.647，P＜ 0.05）。Dialister菌屬在在多重HR-HPV陽性組出現了豐度上調，差異有統計學意義（Z=3.479，P＜ 0.05）。圖1D顯示單一HR-HPV陽性組和多重HR-HPV陽性組之間存在豐度差異的關鍵陰道菌屬是Lactobacillus菌屬、Prevotella菌屬和Anaerococcus菌屬。

圖1 不同HR-HPV感染型別亞組間陰道菌群分析結果

2.2 不同級別宮頸病變組間陰道菌群分析

2.2.1 不同級別宮頸病變組間陰道菌群的β多樣性分析、PLS-DA分析 圖2A中所示，慢性炎癥組、LSIL組和HSIL組的陰道菌群結構比較，差異有統計學意義（H=11.653，P＜ 0.05）。圖2B和2C顯示，組間兩兩分析比對，慢性炎癥組與LSIL組、LSIL組與HSIL組的陰道菌群結構比較，差異有統計學意義（Z=2.782，2.649，P＜ 0.05）。圖2D是PLS-DA分析圖，顯示不同級別病變組陰道菌群的物種組成存在不同。

圖2 不同級別宮頸病變組間陰道菌群的β多樣性分析、PLS-DA分析

2.2.2 不同級別宮頸病變組間陰道菌群的微生物物種組成分析 分析不同級別宮頸組織病變組中陰道菌群占比前10的關鍵細菌屬，圖3A顯示慢性炎癥組和LSIL組間，Ureaplasma菌屬占比，差異有統計學意義（Z=2.816，P＜ 0.05）。圖3B顯示慢性炎癥組和HSIL組間，Enterococcus菌屬占比差異有統計學意義（Z=3.673，P＜ 0.05）。

圖3 不同級別宮頸病變組間陰道菌群的微生物物種組成分析

3 討論

3.1 持續HR-HPV感染的陰道菌群特征

本研究發現，單一型別和多重HR-HPV陽性組之間，存在乳酸桿菌屬（Lactobacillus）、普雷沃氏菌屬（Prevotella）和Anaerococcus菌屬的占比差異，說明這些菌屬的豐度變化可能對HR-HPV的持續性感染或者清除產生了影響。HR-HPV陽性組中，普遍出現了Lactobacillus屬豐度下調。正常情況下，處于優勢地位的乳酸桿菌屬能產生多種抑制物質，如乳酸和細菌素等以防止致病性感染，維持生殖器上皮表面的完整性，這一特征對于維持宮頸上皮屏障功能防止HPV進入基底層細胞很重要[6]，它們還能調節宿主的免疫功能，影響疾病的易感性[7]。因此，乳酸桿菌屬的減少引起的病原菌增殖、陰道微生物平衡破壞，增加了HR-HPV的易感性和持續感染狀態，最后導致宮頸病變的發生。

普雷沃氏菌屬（Prevotella）豐度在HR-HPV陽性的各亞組中均出現了不同程度的上調。普雷沃氏菌屬被證實與細菌性陰道病顯著相關，而細菌性陰道病已被證實與HR-HPV感染顯著相關，有研究證實普雷沃氏菌屬在CIN的發生發展中可作為生物標志物[8]。此外，普雷沃氏菌屬會產生膠原酶和纖溶酶，它們可以降解黏膜表面，促進陰道上皮細胞的脫落，以及唾液酸酶和脯氨酸酶，導致陰道上皮損傷，從而引起HR-HPV整合至鱗狀上皮細胞中，進而引起進一步病變[9]。

本研究發現，小桿菌屬（Dialister）的豐度在多重HR-HPV陽性組中出現上調。與既往研究結果相符合，小桿菌屬同樣是HR-HPV感染人群中出現的關鍵陰道菌群。陰道菌群存在小桿菌屬的女性，清除HPV更加困難，也更容易產生HPV的持續性感染[10]。但尚無研究探明小桿菌屬如何在抑制HPV清除的過程中發揮作用，這個菌屬同樣需要更進一步的研究。

3.2 不同級別的宮頸病變組的陰道菌群特征

本研究結果顯示HSIL組的陰道菌群物種多樣性表現出更加明顯的增加。既往有研究表明陰道菌群發生變化可能是HSIL發生發展的危險因素[11]。另一項支持這一結論的是HSIL女性手術切除前后的陰道菌群研究，該研究發現，HSIL患者乳桿菌屬的多樣性降低，同時伴有促炎細胞因子和抗菌肽濃度升高。錐切手術可以降低抗菌肽水平，但無法改變陰道微生物的組成或細胞因子水平。這意味著HSIL更傾向于發生在菌群多樣性減少的陰道環境中，而這種環境并不能通過手術切除病灶和清除HPV來糾正[12]。未能重建富含乳酸桿菌的陰道環境可能是HSIL患者術后出現HPV持續感染和HSIL復發的原因。

本研究發現解脲支原體（Ureaplasma）在LSIL組中出現上調，提示LSIL的發生可能與解脲支原體相關，有研究表明，解脲支原體增加了HPV感染風險[13]，可能作為輔助因素影響HPV促進癌前病變導致CC[14]，同樣的，一項針對182名宮頸鱗狀上皮內病變女性的研究證實，宮頸鱗狀上皮內病變患者有顯著更高的解脲支原體感染率[15]。解脲支原體和宮頸病變致病機制的研究中發現，該菌屬可能參與了幾種復雜的感染相關的炎癥反應，包括產生一系列的反應性氧化代謝產物，促進趨化因子、細胞因子表達增加，抑制細胞介導的免疫反應，促使自由基的產生等[16]。有研究證實從LSIL組到宮頸癌組，腸球菌屬的豐度持續增加，宮頸癌組的豐度最高[17]。本研究HSIL組的腸球菌屬（Enterococcus）較慢性炎癥組出現了下調，與其結論不相符，需擴大樣本進一步證實腸球菌屬在宮頸疾病進程中的作用。

綜上所述，HR-HPV的持續性感染與陰道菌群的失衡密切相關。而本研究中發現HR-HPV感染相關的菌群包括乳酸桿、普雷沃氏等，尚無法完全明確這些菌屬在HPV持續感染抑或清除過程中發揮的具體作用，這也為下一步研究陰道菌群的變化與HPV持續感染并導致宮頸病變的機制提供了新方向。