龍巖市新生兒遺傳代謝病串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)篩查結(jié)果分析

藍(lán)金金 廖貞金 袁麗萍

1.福建省龍巖市第一醫(yī)院兒?？?，福建龍巖 364000；2.福建省龍巖市第一醫(yī)院檢驗(yàn)科，福建龍巖 364000

遺傳代謝?。╥nherited metabolic diseases，IMDs）是基因突變導(dǎo)致維持機(jī)體正常代謝所需的某些酶、載體以及受體合成中出現(xiàn)缺陷導(dǎo)致機(jī)體生化代謝發(fā)生紊亂，導(dǎo)致在旁路或中間發(fā)生蓄積，代謝產(chǎn)物不斷缺少，產(chǎn)生一系列臨床異常的一大類(lèi)疾病，其病種繁多、群體發(fā)病率高，延誤治療將導(dǎo)致發(fā)育障礙、智力低下、病死等不可逆損害[1]。新生兒遺傳代謝病串聯(lián)質(zhì)譜（tandem mass spectrometry，MS/MS）篩查可篩檢幾十種IMDs。該技術(shù)因其具有快速、靈敏、高通量和選擇性強(qiáng)等特點(diǎn)，以提高篩查的敏感度和特異度，讓IMDs篩查進(jìn)入新階段。福建省龍巖市串聯(lián)質(zhì)譜項(xiàng)目開(kāi)展較晚，目前尚無(wú)此類(lèi)研究報(bào)道。本文通過(guò)對(duì)2018年12月11日至2020年12月15日龍巖市新生兒疾病篩查分中心開(kāi)展串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)新生兒IMDs篩查項(xiàng)目，對(duì)各定點(diǎn)助產(chǎn)機(jī)構(gòu)送檢的58 934例新篩進(jìn)行回顧性分析，分析龍巖地區(qū)IMDs情況。

1 資料與方法

1.1 一般資料

研究分析2018年12月11日至2020年12月15日龍巖市下屬的各助產(chǎn)機(jī)構(gòu)送龍巖市新生兒疾病篩查分中心初篩樣本共計(jì)58 934例，以新生兒干血斑為樣本，采用MS/MS進(jìn)行遺傳代謝病篩查。納入標(biāo)準(zhǔn)：符合《新生兒疾病篩查技術(shù)規(guī)范》[2]的標(biāo)準(zhǔn)，出生72 h經(jīng)充分哺乳（6次以上）或7 d以內(nèi)，以及由于各種原因（早產(chǎn)兒、低體重兒、處于治療疾病期的新生兒等）最遲不超過(guò)20 d的新生兒。排除標(biāo)準(zhǔn)：分娩時(shí)已經(jīng)病死的新生兒；7 d內(nèi)病死的新生兒；家長(zhǎng)不同意進(jìn)行篩查的新生兒。

1.2 方法

1.2.1 樣本采集和遞送 采集符合研究標(biāo)準(zhǔn)的新生兒足跟血，滴在專(zhuān)用濾紙片上，收集4個(gè)正反面滲透完好的血斑，在室溫下自然晾干，再轉(zhuǎn)移到2～6℃環(huán)境中存放，采集樣本在5 d內(nèi)送至篩查分中心，經(jīng)分中心驗(yàn)收合格后進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.2 儀器與試劑 儀器為美國(guó)Waters公司的串聯(lián)質(zhì)譜系統(tǒng)，超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀UPLC I-Class/Xevo TQD；試劑為專(zhuān)用的非衍生化多種氨基酸測(cè)定試劑、肉堿測(cè)定試劑和琥珀酰丙酮測(cè)定試劑盒。

1.2.3 檢測(cè)方法 將濾紙血片打孔3 mm圓形放在96孔微孔板中，使用非衍生化法對(duì)樣本進(jìn)行處理，在微孔板中加入琥珀酸丙酮、氨基酸、肉堿的同位素內(nèi)標(biāo)萃取液，封膜后，在45℃恒溫震蕩，萃取45 min，再吸取75 μl到96孔微孔板上，再用鋁膜覆蓋后鏈接質(zhì)譜儀檢測(cè)。將初篩結(jié)果顯示陽(yáng)性或弱陽(yáng)性的標(biāo)本召回采血復(fù)查，復(fù)查后有結(jié)果異常的繼續(xù)召回，召回至龍巖市新生兒疾病篩查分中心臨床醫(yī)生看診后，繼續(xù)采血復(fù)查，并進(jìn)行尿液氣相色譜-質(zhì)譜進(jìn)行有機(jī)酸分析和新一代測(cè)序技術(shù)（next-generation sequencing technology，NGS）檢測(cè)陽(yáng)性患兒的突變基因，同時(shí)進(jìn)行臨床治療，并納入新生兒疾病篩查管理系統(tǒng)進(jìn)行隨訪。

1.3 結(jié)果判定

氨基酸代謝異常：MS/MS結(jié)果顯示血苯丙氨酸＞120 μmol/L的患兒予以尿蝶呤譜+二氫蝶啶還原酶分組活性測(cè)定，排除四氫生物蝶呤（BH4）缺乏癥后血苯丙氨酸≥360 μmol/L的患兒可確診為苯丙酮尿癥，＜360 μmol/L可確診為輕度高苯丙氨酸血癥[3]。

脂肪酸代謝障礙：MS/MS中血漿肉堿持續(xù)明顯降低確診為原發(fā)性肉堿吸收障礙。

有機(jī)酸代謝障礙[4]：患兒給予過(guò)尿氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（GCMS）明確診斷，戊二酰肉堿，戊二酰肉堿/辛酰肉堿均升高，且基因分析GCDH 2個(gè)等位基因具有致病突變可確診為戊二酸血癥Ⅰ型。尿同型胱氨酸檢測(cè)顯示過(guò)量含硫氨基酸則診斷為甲基丙二酸血癥。

本研究檢測(cè)結(jié)果錄入Neolynx軟件進(jìn)行分析，經(jīng)院內(nèi)專(zhuān)科醫(yī)生審核報(bào)告后再發(fā)放結(jié)果。

2 結(jié)果

2018年12月11日 至2020年12月15日 共篩查58 934例初篩樣本，檢出可疑陽(yáng)性1576例（2.67%），經(jīng)后續(xù)常規(guī)檢驗(yàn)和NGS檢測(cè)確定診斷患兒11例，其中確診原發(fā)性肉堿缺乏癥（primary carnitine deficiency，PCD）2例，精氨酸血癥1例，2-甲基丁酰輔酶A脫氫酶缺乏癥1例，丙酸血癥1例，3-甲基巴豆酰輔酶A羧化酶缺乏癥1例，戊二酸血癥Ⅰ型1例，高甲硫氨酸血癥1例，異丁酰輔酶A脫氫酶缺乏癥1例，2例母源性患者。具體數(shù)據(jù)見(jiàn)表1～2。

3 討論

MS/MS是近些年發(fā)展起來(lái)的分析復(fù)雜混合物的技術(shù)，與傳統(tǒng)色譜-質(zhì)譜技術(shù)更能適應(yīng)較為復(fù)雜的樣品分析，樣本不經(jīng)過(guò)處理可直接進(jìn)行分析。串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)從20世紀(jì)80年代應(yīng)用于新生兒IMDs的篩查中，通過(guò)對(duì)數(shù)十種小分子代謝物的分析，可篩查脂肪酸氧化代謝紊亂、有機(jī)酸、氨基酸等代謝疾病。新生兒IMDs的篩查可不斷擴(kuò)展篩查疾病譜，不斷提高篩查的敏感度、特異度、準(zhǔn)確度等。

在58 934例篩查樣本中，初篩出可疑陽(yáng)性病例1576例（2.67%），召回復(fù)查1330例（陽(yáng)性召回率84.39%），最終確診9例患者和2例母源性患者（本文未統(tǒng)計(jì)PAH、BH4相關(guān)病例）。整體發(fā)病率約為1/5358，較福建泉州地區(qū)發(fā)病率低一些[5]，可能是由地區(qū)性差異或整體樣本量不足導(dǎo)致。雖然，整體發(fā)病率低于其他地區(qū)，但所檢出的疾病都具有重要意義，尤其是發(fā)病率（1/19644）較高的PCD。

表2 11例陽(yáng)性確診病例的基因檢測(cè)結(jié)果

PCD為臨床常見(jiàn)的代謝障礙疾病，主要表現(xiàn)為脂肪酸氧化代謝異常，發(fā)病率與種族有關(guān)[6-7]，本市的發(fā)病率為1/19 644，高于浙江省的1/25 131，而低于同省泉州地區(qū)的1/10 126[8]，表明該病可能具有一定的地域差異性。由于PCD臨床表現(xiàn)不明顯，且無(wú)特異性，容易發(fā)生誤診或漏診，有些患者終身不發(fā)病但也存在因病致死患者，根據(jù)患者臨床表現(xiàn)很難早期診斷。此外，新生兒基因突變會(huì)導(dǎo)致體內(nèi)肉堿含量缺乏，直接影響新生兒血中CO水平，在胎兒孕育過(guò)程中CO水平偏低是導(dǎo)致新生兒CO偏低的主要原因[9]。本文中的案例11，患兒篩查肉堿遠(yuǎn)低于正常水平，基因結(jié)果卻為SLC22A5基因c.428C＞T位點(diǎn)單雜合，而母親基因結(jié)果為同一位點(diǎn)的純合突變，單純檢測(cè)新生兒CO水平不能確診為PCD患兒，PCD母源性也是主要的發(fā)病因素，需要對(duì)新生兒母親進(jìn)行治療，以避免對(duì)心、肝、腦等器官的損害。

目前在MS/MS中也存在許多問(wèn)題，具有較強(qiáng)的分析技術(shù)，成本儀器較高，并且氨基酸、?；鈮A分析的試劑價(jià)格昂貴，在該技術(shù)要求上需要不斷豐富實(shí)驗(yàn)技能，以釋放復(fù)雜的代謝途徑，在一定程度上限制了在實(shí)驗(yàn)室的應(yīng)用[10]。采用免疫熒光串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定琥珀酰丙酮未發(fā)現(xiàn)假陰性情況。另外新生兒篩查B-胱硫醚合成酶不能作為蛋氨酸的可靠標(biāo)志物[11]。在采用串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)應(yīng)用前多采用細(xì)菌抑制法測(cè)定血濾紙片蛋氨酸的水平。MS/MS的敏感度在很大程度上依賴(lài)于截?cái)嘀?，在低體重新生兒或早產(chǎn)兒倡導(dǎo)外影像會(huì)影響?；鈮A、氨基酸的濃度，特別是在低出生體重的患兒中假陽(yáng)性率明顯高于正常新生兒[12]。出生后年齡直接影響標(biāo)志物的變化，標(biāo)志物在出生一周內(nèi)會(huì)發(fā)生變化，需要建立不同的胎齡、體重、日齡指標(biāo)進(jìn)行截?cái)嘀档慕y(tǒng)計(jì)，以提高檢測(cè)指標(biāo)的參考性，降低假陽(yáng)性率的發(fā)生[13]。

本研究表明，新生兒遺傳代謝篩查對(duì)遺傳疾病診斷有重要意義，通過(guò)對(duì)新生兒IMDs進(jìn)行有目的的篩查，可降低新生兒因相關(guān)疾病所導(dǎo)致的重要臟器的損害甚至猝死等風(fēng)險(xiǎn)，亦可篩查部分母親患者，預(yù)防成人發(fā)病的同時(shí)，也為二胎產(chǎn)前診斷提供指導(dǎo)[14]。諸多IMDs的陽(yáng)性結(jié)果不能單一代表代謝物濃度，可試用多參數(shù)指導(dǎo)篩查結(jié)果，以提高篩查的特異度和敏感度，但有些患兒和母體無(wú)明顯癥狀，臨床診斷帶來(lái)困難[15-16]。通過(guò)MS/MS可明確篩查出輔酶A脫氫酶缺乏癥情況，以降低發(fā)病率。串聯(lián)質(zhì)譜為多種色譜串聯(lián)系統(tǒng)，能起到更為準(zhǔn)確的分離效率，可明顯區(qū)分多肽或蛋白質(zhì)的差別，通過(guò)串聯(lián)質(zhì)譜進(jìn)行分析。也可利用陰離子電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜，通過(guò)定量分析膽汁酸水平篩查肝膽管性疾病，在非衍生物下進(jìn)行分析，以保證篩查結(jié)果的準(zhǔn)確度。但是本研究中也發(fā)現(xiàn)MS/MS存在假陽(yáng)性較高的情況，考慮與MS/MS篩查時(shí)所選擇的截?cái)嘀涤嘘P(guān)。不同地域的新生兒體內(nèi)有機(jī)酸水平可能存在一定差異，如果使用統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩查，可能會(huì)導(dǎo)致不同地域的新生兒出現(xiàn)假陽(yáng)性或者假陰性診斷結(jié)果。因此應(yīng)該探索各個(gè)地區(qū)不同的標(biāo)準(zhǔn)，以增加診斷的準(zhǔn)確度。

綜上所述，新生兒IMDs的MS/MS篩查對(duì)新生兒IMDs的早發(fā)現(xiàn)、早診斷及早干預(yù)具有重要意義，是三級(jí)預(yù)防的重要手段，對(duì)于提高人口質(zhì)量意義重大。