2，4-二叔丁基苯酚對細葉小羽蘚生理的影響

宋春燕，王 琪，單壹壹，李丹丹，于 晶

（上海師范大學生命科學學院，上海 200234）

0 引言

苔蘚植物是一類獨特的高等植物類群，其形態結構矮小，有莖和葉的分化，莖葉一般由單層或少數幾層細胞構成，體表無蠟質的角質層，或角質層不發達，無維管束組成的輸導組織，無真正的根，其根稱之為“假根”，僅具有吸附作用［1］.苔蘚植物營養物質來自莖葉體表吸收，對環境變化特別敏感，獨特的生物學特性使其被廣泛應用于環境質量的生物指示和監測［2］.苔蘚植物具有涵養水源、保持水土、循環與貯存營養物質、森林更新、重建與恢復植被等生態功能，是生態系統中必不可少的一類群體［3］.細葉小羽蘚（Haplocladium microphyllum（Sw.ex Hedw.）Broth.）為羽蘚科（Thuidiaceae）小羽蘚屬（Haplocladium）的一種苔蘚植物，色澤鮮綠，植株纖細，生長交織錯落有致，不僅具有較高的生態價值，還具有清熱解毒、消炎等藥用價值.隨著城市化快速發展，部分地區干旱化程度不斷加深，而細葉小羽蘚既可豐富城市園林植物種類，還可維持植物群落的生態平衡，再現豐富多樣的自然景觀［4-6］.本文作者在野外工作時，觀察發現我國東南沿海地區木麻黃林地鮮有苔蘚植物的分布，目前不清楚木麻黃林地化感物質對苔蘚植物的生長發育是否有影響.

木麻黃是我國東南沿海防護林主要樹種，在東南海岸已有70多年的栽培歷史，其主要作用在于防風固沙、改良土壤和改善海岸帶生態環境等［7］.但由于木麻黃防護林樹種單一，群落結構簡單，木麻黃所產生的化感物質可以通過自然揮發、雨霧淋溶、根系分泌、植物殘體分解等途徑聚積在土壤中，這些有毒物質不斷積累，不僅抑制自身林下幼苗生長，而且對其他植物產生化感作用［8］.YAO等［9］在木麻黃的凋落物、土壤、根中均檢測出2，4-二叔丁基苯酚（2，4-DTBP）等酚酸類物質，且2，4-DTBP的相對含量最高.2，4-DTBP是一種黃白色結晶固體，不溶于水，至少來源于169種生物［10］，如細菌［11-12］、真菌［13］、高等植物［14-15］等的天然化合物，具有抗氧活性［16］、抗菌殺蟲活性［17-18］、抗炎活性［19］、植物化感效應［20］和除草效應［15］等性質.QIN等［21］研究發現2，4-DTBP對萵苣（Lactuca sativaL.）、水稻（Oryza sativaL.）以及稗草（Echinochloa crus-galliL.）的種子萌發和幼苗生長化感抑制活性相對最強.ZHANG等［22］在不同植齡啤酒花（Humulus lupulusL.）根系分泌物及根際土壤中檢測出2，4-DTBP的相對含量最高，實驗結果表明，適宜低濃度的2，4-DTBP對啤酒花生長和光合特性具有促進作用，而高濃度的2，4-DTBP能對啤酒花的生長產生化感抑制效應.XUAN等［23］從茅草（Imperata cylindrica（L.）Beauv.）的根莖和根系分泌物中提取出的2，4-DTBP對雜草萌發和幼苗生長具有化感抑制作用.GAO等［24］探究內蒙古荒漠草原優勢植物根分泌物2，4-DTBP對根際微生物的影響時，發現當2，4-DTBP質量濃度高于7.5 g·μL-1時，會對部分細菌生長有抑制效應，土壤細菌物種多樣性明顯降低.

木麻黃林地中化感物質2，4-DTBP相對含量最高，因此，本研究通過施加不同濃度的2，4-DTBP處理細葉小羽蘚，研究2，4-DTBP對細葉小羽蘚葉綠素、脯氨酸、丙二醛含量的影響，揭示2，4-DTBP對苔蘚植物的化感作用，為探究細葉小羽蘚是否適應木麻黃林地生態環境提供參考.

1 材料與方法

1.1 實驗材料

于2020年12月11日在康健園、桂林公園、上海師范大學徐匯校區、奉賢校區采集適量細葉小羽蘚，用蒸餾水洗凈泥土，去除雜質.以吸水性紗布作為基質，將紗布高溫滅菌后，浸沒于蒸餾水中，使紗布吸滿水，然后將紗布平鋪在廣口淺盆中.把已經洗凈的細葉小羽蘚植物體均勻地種植于紗布表面上，放入光照恒溫培養箱里培養，設定光照12 h/黑暗12 h，溫度22℃，每2 d噴灑蒸餾水50 mL［25］.將其馴化至植物體生長良好狀態，周期為1周.

1.2 實驗方法

1.2.1 培養方法

選取馴化后生長一致的植株繼續培養.選擇木麻黃分泌物中的化感物質2，4-DTBP，采用化學分析純（購買自國藥集團）作為外源模擬生化試劑.每7 d噴灑一次物質的量濃度分別為0（CK），0.01，0.05，0.10，0.50，1.00 mmol·L-1的2，4-DTBP試劑，每次噴灑50 mL，每周測量一次光合色素、脯氨酸和丙二醛的含量，做3次平行實驗，實驗周期為8周.

1.2.2 測量方法

光合色素的提取測量采用BAO等［26］的方法.比色測定色素，以95%（體積分數）乙醇為空白對照，在665和649 nm波長下測定吸光度，計算葉綠素a、葉綠素b含量，參照WANG［27］方法，采用酸性茚三酮法測量脯氨酸含量，采用硫代巴比妥酸（TBA）法測量丙二醛含量.

1.3 數據處理方法

實驗數據使用Microsoft Excel 2019軟件進行統計分析，運用SPSS進行顯著性差異分析，并用Origin 2019進行制圖.

2 結果與分析

2.1 2,4-DTBP對細葉小羽蘚葉綠素含量的影響

2，4-DTBP對細葉小羽蘚葉綠素a含量存在“低促高抑”的現象，如圖1所示.

當2，4-DTBP物質的量濃度在0～0.05 mmol·L-1時，細葉小羽蘚的葉綠素a含量明顯高于對照組，差異達到顯著性水平（P＜0.05），且隨著2，4-DTBP濃度增加，葉綠素a含量逐漸增加.當2，4-DTBP物質的量濃度為0.05～0.10 mmol·L-1時，葉綠素a含量出現最高值，比對照組增加9.75%～62.46%.但當2，4-DTBP物質的量濃度增加至0.50 mmol·L-1時，葉綠素a含量略低于或約等于對照組.當2，4-DTBP物質的量濃度增加至1 mmol·L-1時，葉綠素a含量低于對照組，差異達到顯著性水平（P＜0.05），比對照組降低0.04%～24.00%.隨著實驗周期的增加，葉綠素a的含量逐漸減少，且低于對照組，除第二周外.2，4-DTBP物質的量濃度為0～0.1 mmol·L-1時，葉綠素a+b含量高于對照組，差異達到顯著性水平（P＜0.05），且隨著2，4-DTBP濃度增加，葉綠素a+b含量逐漸增加.當2，4-DTBP物質的量濃度大于0.50 mmol·L-1時，葉綠素a+b含量相比于對照組無顯著差異，如圖2所示.

圖2 不同濃度2，4-DTBP處理下細葉小羽蘚中葉綠素a+b含量隨處理時間的變化

由圖1，2可知，適宜物質的量濃度（0～0.10 mmol·L-1）的2，4-DTBP能夠使得細葉小羽蘚的葉綠素含量增加；而2，4-DTBP物質的量濃度大于0.50 mmol·L-1時，細葉小羽蘚的葉綠素含量下降.

圖1 不同濃度2，4-DTBP處理下細葉小羽蘚中葉綠素a含量隨處理時間的變化.同一行中的不同的小寫字母表示0.05水平差異顯著性，下同.

2.2 2,4-DTBP對細葉小羽蘚脯氨酸含量的影響

如圖3所示，當2，4-DTBP物質的量濃度在0～0.05 mmol·L-1時，脯氨酸含量低于對照組，差異達到顯著性水平（P＜0.05），且隨著2，4-DTBP濃度的增大，脯氨酸含量逐漸降低.在2，4-DTBP物質的量濃度為0.05 mmol·L-1時，脯氨酸含量達到最低值，差異達到顯著性水平（P＜0.05），比對照組降低0.58%～2.88%；2，4-DTBP物質的量濃度增加至0.50 mmol·L-1時，脯氨酸含量略高于對照組.當2，4-DTBP物質的量濃度增加至1.00 mmol·L-1時，脯氨酸含量高于對照組的趨勢更加明顯，差異達到顯著性水平（P＜0.05），比對照組高2.11%～3.09%.結果表明，用低濃度2，4-DTBP處理時，細葉小羽蘚脯氨酸含量降低，而較高濃度的2，4-DTBP使得細葉小羽蘚脯氨酸含量提高.

圖3 不同濃度2，4-DTBP處理下細葉小羽蘚中脯氨酸含量隨處理時間的變化

2.3 2,4-DTBP對細葉小羽蘚丙二醛含量的影響

如圖4所示，當2，4-DTBP物質的量濃度在0～0.10 mmol·L-1時，丙二醛含量低于對照組，差異達到顯 著 性 水 平（P＜0.05），且 隨 著2，4-DTBP濃 度 的 增 大，丙 二 醛 含 量 逐 漸 降 低.當2，4-DTBP物質的量濃度為0.10 mmol·L-1時，丙二醛含量出現最低值，差異達到顯著性水平（P＜0.05），比對照組降低7.20%～23.01%，但當2，4-DTBP物質的量濃度大于0.50 mmol·L-1時，丙二醛含量開始逐漸回升.當2，4-DTBP物質的量濃度增加至1.00 mmol·L-1時，丙二醛含量趨近于對照組，差值在-4.18%～0.73%波動.結果表明，用低濃度2，4-DTBP處理時，細葉小羽蘚丙二醛含量降低，而高濃度2，4-DTBP使得細葉小羽蘚丙二醛含量提高.

圖4 不同濃度2，4-DTBP處理下細葉小羽蘚中丙二醛含量隨處理時間的變化

3 結論與討論

植物光合作用具有制造有機物，實現太陽能的轉化與儲存，為地球上的生物提供直接或間接的能源，穩定大氣中的氧和二氧化碳的含量等重要意義［28］.葉綠素是光合作用必不可少的色素，是吸收光能的物質基礎，是光合作用的光敏催化劑，直接影響光合作用的強弱，其含量是植物適應環境生長發育的重要指標［29］.ZHANG等［22］的研究結果表明，低濃度的2，4-DTBP對啤酒花幼苗光合作用有一定促進作用，而高濃度的2，4-DTBP抑制光合作用強度.本研究也得出相似結論，低物質的量濃度（＜0.10 mmol·L-1）的2，4-DTBP能促進細葉小羽蘚葉綠素的合成，高物質的量濃度（＞0.50 mmol·L-1）的2，4-DTBP能促使葉綠素降解.

脯氨酸在植物體內是一種滲透調節物質，逆境條件下，植物體內脯氨酸含量會有明顯的積累，有利于減輕逆境對植物的傷害，同時在一定程度上反映了植物的抗逆性［30］.LI等［31］研究4種苔蘚植物對不同水族箱水體條件的生理響應，發現隨著水淹時間的延長，植物葉中脯氨酸積累，調節逆境環境條件下的適應能力.本研究得出如下結論：在2，4-DTBP物質的量濃度低于0.10 mmol·L-1的環境里，細葉小羽蘚的脯氨酸含量增加不明顯，當2，4-DTBP物質的量濃度高于0.50 mmol·L-1時，細葉小羽蘚的脯氨酸含量增加明顯.細葉小羽蘚能適應低濃度的2，4-DTBP環境，在高濃度的2，4-DTBP環境里則產生大量脯氨酸以減輕逆境對其生長的傷害，并反映了高濃度的2，4-DTBP對苔蘚植物的生理活動有一定影響.

活性氧的產生和相關的氧化應激被認為是植物感化效應的主要作用機制［32］.2，4-DTBP能通過活性氧的生成誘導氧化應激，引起根系組織和葉片組織中葉綠體的脂質過氧化和膜損傷［15］.丙二醛是植物細胞質膜過氧化的最終產物，其含量的多少顯示了植物細胞質膜過氧化的程度，可作為檢測逆境條件下膜系統受損程度的指標［33］.HALIM［34］等研究了2，4-DTBP對雜草植物葉片葉綠體超微結構和葉片生理的影響，研究結果表明，葉綠體的超微結構損傷明顯，類囊體系統紊亂，膜呈波動狀，淀粉粒缺乏，質體球蛋白增多，葉片綠度、量子產量和氣孔導度值降低.ZHOU等［35］探究不同濃度2，4-DTBP對番茄葉霉菌及番茄種子萌發幼苗生長的影響，得出低濃度2，4-DTBP處理能使番茄葉片中丙二醛含量下降，降低膜脂過氧化程度，但處理濃度過大時，將影響植物自我調節能力，膜脂過氧化作用增強.這與本研究結果一致，低濃度（＜0.10 mmol·L-1）的2，4-DTBP能夠降低細葉小羽蘚的丙二醛含量，而高濃度（＞0.50 mmol·L-1）的2，4-DTBP能夠提高細葉小羽蘚的丙二醛含量.使用低濃度的2，4-DTBP處理苔蘚植物，并未使其體內活性氧增多，所以丙二醛含量不高.而高濃度的2，4-DTBP使苔蘚植物體內活性氧大量積累，促進膜脂過氧化作用增強，使膜結構遭到破壞，丙二醛含量升高.

綜上所述，低濃度的2，4-DTBP對細葉小羽蘚生長具有促進作用，但高濃度的2，4-DTBP對細葉小羽蘚生長具有抑制作用.我國東南沿海木麻黃林地的化感物質2，4-DTBP大量累積，其濃度已高于適宜細葉小羽蘚生長發育的最適濃度，對細葉小羽蘚生長繁殖有一定抑制效應.

本研究僅以木麻黃林地化感物質中含量最為豐富的2，4-DTBP溶液對細葉小羽蘚生理反應進行室內實驗，尚未能在木麻黃林地開展野外實驗.且實驗只以細葉小羽蘚為研究對象，苔蘚植物豐富多種，如毛尖紫萼蘚（Grimmia piliferaP.Beauv.）［36］、山墻蘚（Tortula ruralis（Hedw.）G.Gaertn.，B.Mey.&Scherb.）［37］等耐旱苔蘚植物，具有脅迫耐受性，因此，還需對更多種苔蘚植物進行化學物質脅迫實驗研究，為苔蘚植物是否能適應木麻黃林地生態環境提供參考.