紅花龍膽藥材的UPLC指紋圖譜研究與芒果苷含量測定 Δ

楊朝堃，徐仕娟，徐文芬 ，孫慶文，王 波，郭江濤，張永萍（貴州中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，貴陽 550025）

紅花龍膽為貴州常用苗藥之一，為龍膽科植物紅花龍膽Gentiana rhodanthaFranch.的干燥全草，具有清熱除濕、解毒、止咳等功效，臨床上常用于治療肺熱咳喘、小兒肺炎、支氣管炎等[1—3]。紅花龍膽的主要化學(xué)成分包括（裂）環(huán)烯醚萜類、黃酮類、酚酸類等化合物[4]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，紅花龍膽具有良好的抗炎、抗氧化、抗菌等活性[5—7]。目前國內(nèi)外關(guān)于紅花龍膽的質(zhì)量控制研究較為薄弱，2020年版《中國藥典》（一部）僅以芒果苷為指標性成分來控制紅花龍膽的藥材質(zhì)量[3]，但這種單指標的質(zhì)量控制模式不僅難以全面反映藥材質(zhì)量的優(yōu)劣，而且無法保證相關(guān)制劑的療效穩(wěn)定，在一定程度上制約了該藥材的開發(fā)利用。因此，進一步完善紅花龍膽的質(zhì)量評價體系十分必要。

中藥指紋圖譜具有豐富的數(shù)據(jù)及變量，能較為直觀地反映中藥的化學(xué)物質(zhì)信息，從而揭示中藥化學(xué)組成的復(fù)雜性[8]。目前指紋圖譜技術(shù)已廣泛用于中藥、民族藥及各類中藥制劑的質(zhì)量控制研究[8—12]。與單一或少數(shù)幾個指標性成分的質(zhì)量控制模式相比，指紋圖譜質(zhì)量控制模式更加科學(xué)和全面，符合中藥多成分、多靶點的作用特點，適用于中藥質(zhì)量的整體性評價，能客觀反映藥物的一致性和穩(wěn)定性。因此，本研究采用超高效液相色譜（UPLC）法，通過相似度評價，并結(jié)合化學(xué)計量學(xué)方法對紅花龍膽藥材的指紋圖譜進行分析，同時測定了該藥材中芒果苷的含量，以期為完善該藥材及相關(guān)制劑的質(zhì)量控制體系提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

Thermo UltiMate 3000型UPLC儀及DAD檢測器、四元梯度泵、ChromeleonTM色譜工作站均購自美國Thermo Fisher Scientific公司；AG135型十萬分之一電子天平購自瑞士Mettler-Toledo公司；KQ-500DE型超聲波清洗器購自昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 主要藥材與試劑

對照品馬錢苷酸（批號111865-201704）、獐牙菜苦苷（批號110785-201404）、當藥苷（批號111742-200501）、芒果苷（批號111607-201704）均購于中國食品藥品檢定研究院，純度均大于98%；對照品新芒果苷（批號PS011463）、異葒草苷（批號PS001039）均購于成都普思生物科技股份有限公司，純度均大于98%。乙腈為色譜純，乙醇為分析純，甲醇包括分析純及色譜純，甲酸、磷酸為優(yōu)級純；水為重蒸餾水。52批紅花龍膽藥材樣品主要采集自貴州省，少量采集自廣西壯族自治區(qū)及云南省（樣品信息見表1），經(jīng)貴州中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院孫慶文教授鑒定均為龍膽科植物紅花龍膽G.rhodanthaFranch.的干燥全草，除去泥沙，曬干或50 ℃低溫干燥，粉碎過三號篩，置于干燥器中備用。

表1 52批紅花龍膽藥材樣品信息

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 供試品溶液的制備 取紅花龍膽藥材粉末0.5 g，精密稱定，置于50 mL具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇15 mL，密塞并稱定質(zhì)量，超聲（頻率40 kHz，功率500 W）提取15 min，冷卻至室溫，用70%甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，過濾，續(xù)濾液用0.22 μm有機系微孔濾膜過濾，即得。

2.1.2 混合對照品溶液的制備 分別取新芒果苷、馬錢苷酸、當藥苷、獐牙菜苦苷、異葒草苷、芒果苷對照品適量，精密稱定，加入70%甲醇溶解制成上述成分質(zhì)量濃度依次為0.050、0.048、0.009、0.200、0.009、0.525 mg/mL的混合對照品溶液，備用。

2.2 色譜條件

色譜柱為ZORBAX Eclipse Plus C18（3.0 mm×100 mm，1.8 μm）；流動相為乙腈（A）-0.1%甲酸（B），梯度洗脫（0～3 min，8%A→9%A；3～7 min，9%A→10.3%A；7～10 min，10.3%A；10～19 min，10.3%A→13%A；19～22 min，13%A→18%A；22～34 min，18%A→30%A；34～44 min，30%A→34%A；44～50 min，34%A→63%A）；流速為0.28 mL/min；柱溫為28 ℃；檢測波長為242 nm；進樣量為3 μL。

2.3 指紋圖譜的建立

2.3.1 專屬性考察 分別精密吸取“2.1”項下混合對照品溶液、供試品溶液及70%甲醇（提取溶劑）適量，按“2.2”項下色譜條件進樣檢測，采集并記錄色譜圖（圖1）。結(jié)果顯示，提取溶劑及流動相在該色譜條件下，對紅花龍膽的指紋圖譜測定無干擾；供試品溶液色譜圖中峰容量較大，各主要色譜峰分離較好且純度較高，表明該方法專屬性良好。

圖1 專屬性考察試驗的UPLC圖

2.3.2 精密度試驗 取藥材樣品（S36）適量，按“2.1.1”項下方法制備供試品溶液，按“2.2”項下色譜條件連續(xù)進樣測定6次，以7號峰（芒果苷峰）為參照峰，計算出各共有峰的相對保留時間及相對峰面積的RSD分別為0.04%～0.17%、0.11%～1.80%（n＝6），均小于2.0%，表明該方法精密度良好。

2.3.3 重復(fù)性試驗 取藥材樣品（S36）粉末約0.5 g，精密稱定6份，分別按“2.1.1”項下方法制備供試品溶液，按“2.2”項下色譜條件進樣測定，以7號峰（芒果苷峰）為參照峰，計算出各共有峰的相對保留時間及相對峰面積的RSD分別為0.04%～0.13%、0.69%～2.80%（n＝6），均小于3.0%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗 取藥材樣品（S36）粉末約0.5 g，精密稱定，按“2.1.1”項下方法制備供試品溶液，按“2.2”項下色譜條件分別于室溫放置0、2、4、8、16、24、36、48 h時進樣測定，以7號峰（芒果苷峰）為參照峰，計算出各共有峰的相對保留時間及相對峰面積的RSD分別為0.04%～0.17%、0.11%～1.80%（n＝8），表明供試品溶液在室溫放置48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.5 相似度評價及共有峰的標定 取52批紅花龍膽藥材樣品，分別按“2.1.1”項下方法制備供試品溶液，按“2.2”項下色譜條件進樣測定，采集并記錄色譜圖。將原始圖譜導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2004A版）》，設(shè)置S1為參照圖譜，時間窗寬度為0.5 min，以中位數(shù)法生成對照圖譜，經(jīng)多點校正、自動匹配后生成52批紅花龍膽藥材樣品的指紋圖譜共有模式（圖2）。根據(jù)指紋圖譜匹配結(jié)果共標定出17個共有峰。經(jīng)與混合對照品溶液圖譜（圖1B）比對，供試品溶液色譜圖中1、3、5、6、7、9號共有峰與混合對照品溶液色譜圖中1、3、5、6、7、9號色譜峰的保留時間一致且紫外吸收曲線相同，故確定上述6個共有峰分別為馬錢苷酸（1號峰）、新芒果苷（3號峰）、獐牙菜苦苷（5號峰）、當藥苷（6號峰）、芒果苷（7號峰）與異葒草苷（9號峰）。進一步計算得52批藥材樣品中17個共有峰的相對保留時間及相對峰面積的RSD分別為0.17%～1.30%、20.18%～95.36%，表明52批紅花龍膽藥材樣品指紋圖譜中共有峰的相對保留時間差異較小，但化學(xué)成分含量存在差異。相似度評價結(jié)果顯示，52批紅花龍膽藥材樣品的相似度在0.950～0.996之間，均大于0.9，說明不同產(chǎn)地紅花龍膽藥材的整體化學(xué)成分類似，不同批次間穩(wěn)定性較好。

圖2 52批紅花龍膽藥材樣品UPLC指紋圖譜共有模式

2.4 芒果苷的含量測定

取芒果苷對照品加70%甲醇制成不同濃度梯度的對照品溶液，按“2.2”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，計算得芒果苷的回歸方程為Y＝183.9X+17.352（r＝0.999 9），進樣量線性范圍為525～4 200 μg；精密度試驗結(jié)果顯示，芒果苷峰面積的RSD為1.82%（n＝6）；重復(fù)性試驗結(jié)果顯示，芒果苷的平均含量為75.6 mg/g，RSD為1.70%（n＝6）；48 h穩(wěn)定性試驗結(jié)果顯示，芒果苷峰面積的RSD為1.60%（n＝8）；加樣回收率試驗結(jié)果表明，芒果苷的平均加樣回收率為98.48%，RSD為1.75%（n＝6），均符合2020年版《中國藥典》相關(guān)規(guī)定。樣品含量測定結(jié)果顯示，52批紅花龍膽藥材樣品中芒果苷的含量為18.2～101.0 mg/g，除S4樣品（18.2 mg/g）外，其余批次藥材樣品中芒果苷的含量均符合2020年版《中國藥典》規(guī)定[3]。

2.5 聚類分析

以52批紅花龍膽藥材樣品指紋圖譜中17個共有峰的峰面積為變量導(dǎo)入OriginPro 2021軟件，采用均值聚類法，以歐氏距離為測量區(qū)間，以距離總和查找聚類中心點，進行聚類分析（圖3）。結(jié)果顯示，當歐氏距離大于125時，52批紅花龍膽藥材樣品可明顯分為2類，其中S1～S46、S48～S52聚為一類（Ⅰ類），S47單獨為一類（Ⅱ類）；在Ⅰ類中S1～S46、S48～S49產(chǎn)自貴州，S50～S51產(chǎn)自廣西，S52產(chǎn)自云南，Ⅱ類中的S47產(chǎn)自貴州省銅仁市德江縣，說明不同產(chǎn)地的紅花龍膽具有一定的相似性，相同產(chǎn)地的紅花龍膽具有一定的差異性，其中S47與其他批次樣品相比差異顯著。

圖3 52批紅花龍膽藥材樣品的聚類分析圖

2.6 主成分分析

采用SPSS 26.0軟件對52批紅花龍膽藥材樣品指紋圖譜中的17個共有峰峰面積進行標準化處理，并進行主成分分析（principal component analysis，PCA），取特征值＞1的主成分進行因子分析，計算其相關(guān)系數(shù)矩陣、累計方差貢獻率，對各批次紅花龍膽藥材樣品的質(zhì)量進行評價。結(jié)果顯示，當主成分的變量重要性投影（variable importance in project，VIP）值大于1時，可得到前6個主成分的累計方差貢獻率為82.928%（表2），其可代表大部分成分信息，表明在17個共有成分中，有6個主成分對紅花龍膽藥材的質(zhì)量起主導(dǎo)作用。將52批紅花龍膽藥材樣品的17個共有峰峰面積數(shù)據(jù)作為變量導(dǎo)入SIMCA14.1軟件，建立無監(jiān)督的PCA模型，可得模型提取的前6個主成分累計方差貢獻率的R2X為0.829（大于0.5），表明該模型的擬合效果及穩(wěn)定性較好，能表征不同批次紅花龍膽藥材樣品指紋圖譜的主要信息。由PCA得分圖（圖4）可知，52批紅花龍膽藥材樣品大致可分為2類：S1～S46、S48～S52為一類（Ⅰ類），S47單獨為一類（Ⅱ類），與聚類分析結(jié)果基本一致。除S47樣品外，各批次樣品間的離散程度較低，不同產(chǎn)地的紅花龍膽藥材樣品質(zhì)量差異較小。

表2 52批紅花龍膽藥材樣品PCA的特征值及方差貢獻率

圖4 52批紅花龍膽藥材樣品的PCA得分圖

2.7 正交偏最小二乘法-判別分析

為篩選影響紅花龍膽藥材質(zhì)量的標志性成分，本課題組在聚類分析和PCA的基礎(chǔ)上，將樣品分為2類，以共有峰峰面積為變量，利用SIMCA14.1軟件，建立有監(jiān)督的正交偏最小二乘法-判別分析（orthogonal partial least squares-discriminant analysis，OPLS-DA）模型，得到52批藥材樣品的OPLA-DA得分圖（圖5）。其累積解釋能力參數(shù)（R2X、R2Y）分別為0.691、0.894，均大于0.5，預(yù)測能力參數(shù)（Q2）小于0.5，說明所建立的模型較為穩(wěn)定可靠、預(yù)測能力良好，可用于區(qū)分不同批次的紅花龍膽藥材。由圖5可知，52批紅花龍膽藥材樣品分類明顯，與聚類分析和PCA的分類結(jié)果一致；對OPLS-DA模型進行置換檢驗的結(jié)果顯示，R2、Q2的截距值分別為0.291和-0.582，表明OPLS-DA模型無擬合現(xiàn)象，進一步證實了上述分析結(jié)果的合理性和可行性。以VIP值大于1為評判標準篩選影響紅花龍膽藥材質(zhì)量的差異性成分，結(jié)果顯示5（獐牙菜苦苷）、4、7（芒果苷）、16、14、15號峰的VIP貢獻值分別為1.751 51、1.460 31、1.305 48、1.254 06、1.227 37、1.161 37，表明這6個共有成分可能是影響該藥材質(zhì)量差異的主要標志性成分。

圖5 52批紅花龍膽藥材樣品的OPLS-DA得分圖

各批次樣品分別以7號峰（芒果苷峰）為參照峰計算6個質(zhì)量差異標志性成分的相對峰面積，結(jié)果52批藥材樣品中6個標志性成分的相對峰面積之和為1.140～1.371，其堆積柱形圖如圖6所示，其中S20、S41、S47批次的紅花龍膽藥材質(zhì)量上乘，S1、S14、S21、S26、S34、S39批次的藥材質(zhì)量相對較差，其余批次藥材質(zhì)量中等。

圖6 52批紅花龍膽藥材樣品相對峰面積的堆積柱形圖

3 討論

3.1 色譜條件的優(yōu)化

預(yù)實驗中，本課題組考察了不同檢測波長（242、245、252、270 nm）、流動相系統(tǒng)（甲醇-0.1%甲酸、乙腈-0.1%甲酸）、色譜柱（ZORBAX Eclipse Plus C18、ACQUITY BEH C18Column 130?、Syncronls C18）、柱溫（25、28、30、40 ℃）、流速（0.25、0.28、0.30、0.35 mL/min）對色譜圖的影響，綜合各條件下指紋圖譜的色譜峰信息、基線、峰形、峰數(shù)和分離效果等，最終確定文中色譜條件。

3.2 供試品溶液提取條件的考察

本課題組分別對供試品溶液提取方法（超聲、回流）、提取溶劑（水，30%、50%、70%、90%的甲醇或乙醇）、料液比[1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶70（g/mL）]和提取時間（15、25、35、45、55 min）進行了考察，結(jié)果顯示，在料液比為1∶30（g/mL）、70%甲醇超聲提取15 min的條件下，供試品溶液指紋圖譜的峰容量大，且主要色譜峰的靈敏度和分離度均較好，故選擇該提取條件制備供試品溶液。

3.3 結(jié)果分析

本研究建立了52批紅花龍膽藥材樣品的UPLC指紋圖譜，標定出17個共有峰，并指認了其中6個共有峰，初步揭示了紅花龍膽藥材中化學(xué)成分的整體特征。17個共有峰相對峰面積的RSD在20.18%～95.36%之間，說明不同批次藥材樣品中共有成分的含量差異較大。芒果苷含量測定結(jié)果顯示，52批藥材樣品中僅S4（產(chǎn)自貴州省貴陽市觀山湖區(qū)）的芒果苷含量（18.2 mg/g）不符合2020年版《中國藥典》規(guī)定（芒果苷含量不得少于2.0%），表明本研究所采集的紅花龍膽藥材尤其是貴州境內(nèi)的野生紅花龍膽藥材幾乎均符合藥用標準，這可為相關(guān)企業(yè)采購紅花龍膽野生藥材以及紅花龍膽野生變家種研究的引種馴化和良種選育提供理論依據(jù)。通過相似度評價、聚類分析、PCA和OPLS-DA對52批紅花龍膽藥材樣品的指紋圖譜進行綜合分析，可得不同產(chǎn)地的藥材樣品具有一定的相似性，同一產(chǎn)地的藥材樣品亦具有一定的差異性；進一步篩選出6個影響紅花龍膽藥材質(zhì)量差異的標志性成分，分別為獐牙菜苦苷、芒果苷及4、14、15、16號色譜峰所代表的化學(xué)成分，其中獐牙菜苦苷屬于環(huán)烯醚萜苷類化合物，芒果苷屬于黃酮類化合物，該研究結(jié)果支持現(xiàn)行《中國藥典》將芒果苷作為紅花龍膽藥材質(zhì)量評價指標的可行性。今后，本課題組將進一步對未知的4個質(zhì)量差異標志性成分進行結(jié)構(gòu)鑒定，并針對其藥效學(xué)等進行深入研究；同時，建議以多指標評價紅花龍膽藥材質(zhì)量時可優(yōu)先考慮上述6個成分。

在52批紅花龍膽藥材樣品中，產(chǎn)自廣西、云南兩地的S50～S52樣品質(zhì)量與其余產(chǎn)自貴州的樣品質(zhì)量相近，這可能是由于其采樣點距離貴州較近，生態(tài)環(huán)境與貴州相似所致。而產(chǎn)自貴州不同地區(qū)的紅花龍膽藥材樣品，除S47（產(chǎn)自銅仁市德江縣）外，其余質(zhì)量整體上較為接近；經(jīng)比對發(fā)現(xiàn)，S47的4、5（獐牙菜苦苷）、7（芒果苷）、14、15、16號色譜峰的峰面積較其他批次樣品更大，表明S47樣品中上述6個成分的含量較高，且芒果苷含量測定結(jié)果證實了這一結(jié)論。這可能與德江縣獨特的地貌類型、地勢特點、降雨量、土壤、溫度、光照等環(huán)境因子相關(guān)，提示在現(xiàn)行《中國藥典》標準下，貴州省銅仁市德江縣可能為紅花龍膽藥材的高品質(zhì)產(chǎn)區(qū)。但本研究中該地藥材批次較少，此結(jié)論有待進一步的研究驗證。

綜上所述，本研究所建立的紅花龍膽藥材UPLC指紋圖譜和化學(xué)計量學(xué)分析方法，結(jié)合2020年版《中國藥典》（一部）中該藥材項下芒果苷的含量測定方法，能較為全面地評價該藥材的質(zhì)量，可為該藥材及其相關(guān)制劑的進一步研究提供參考依據(jù)。