樺褐孔菌藥材的薄層色譜鑒別和HPLC指紋圖譜建立及化學模式識別分析 Δ

段雨晴 ，朱田密 ，陳樹和 ，段雪云 ，王思萌 （1.湖北中醫藥大學藥學院，武漢 430065；.湖北省中醫院/湖北中醫藥大學附屬醫院/湖北省中醫藥研究院藥事部，武漢 430061）

樺褐孔菌為銹革孔菌科真菌樺褐孔菌Inonotus obliquus（ Fr.） Pilat的干燥菌核，菌核全年均可采收，為硬木質，不易腐爛[1—3]。樺褐孔菌主要分布于北半球北緯40°～50°地區，如俄羅斯的西伯利亞和遠東地區，日本的北海道及芬蘭、波蘭等地；在我國，主要分布于黑龍江省小興安嶺和吉林省長白山等地[4]。現代研究表明，樺褐孔菌化學成分主要包含多糖類、多酚類、三萜類、甾醇類和葉酸衍生物類等，具有抗腫瘤、降血糖、降血脂、抗氧化、抗病毒等多種藥理作用[5—6]。

樺褐孔菌是一種新來源的真菌類藥材，在歷代醫藥典籍中均無記載，但在地方標準《山東省中藥材標準》（2012版）和《湖北省中藥材質量標準》（2018版）中收載[1—2]。目前，國內外對樺褐孔菌的研究主要集中在化學成分和藥理作用方面，缺乏對樺褐孔菌藥材質量控制的全面研究。《山東省中藥材標準》（2012版）僅從性狀、顯微鑒別、浸出物等方面對樺褐孔菌藥材質量進行控制，未規定指標性成分；《湖北省中藥材質量標準》（2018版）含量測定項下僅以栓菌酸為質量控制的指標，較為單一，難以全面有效地反映樺褐孔菌藥材的質量。故本研究建立樺褐孔菌藥材中三萜類成分栓菌酸、樺褐孔菌醇的薄層色譜鑒別方法和樺褐孔菌藥材的高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜，并應用化學模式識別分析（聚類分析、主成分分析、正交偏最小二乘法-判別分析）評價該藥材的質量，以期為其質量控制提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器有Alliance e2695型高效液相色譜儀、2998型二極管陣列檢測器（美國 Waters公司），ES225SM-DR型電子天平（瑞士Precisa公司），UPT-11-10T型超純水機（深圳優普特技術有限公司），KQ-500VDE型雙頻數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 主要藥品與試劑

栓菌酸對照品由本實驗室自制，純度為93.9%；樺褐孔菌醇、羊毛甾醇對照品均購自上海源葉生物科技有限公司（批號分別為B50360、B27054，純度均不低于95%）；麥角甾醇對照品購自中國食品藥品檢定研究院（批號111845-202105，純度≥96.6%）。本研究所用樺褐孔菌藥材（S1～S18為商品藥材，購自湖北辰美中藥有限公司、保和堂制藥有限公司、廣州康和藥業有限公司；S19～S22為筆者親自采摘后晾干得到）經湖北省中醫院藥事部陳樹和主任藥師鑒定為銹革孔菌科真菌樺褐孔菌I.obliquus（Fr.） Pilat的干燥菌核，樣品信息見表1。

表1 22批樺褐孔菌藥材的樣品信息

2 方法與結果

2.1 樺褐孔菌藥材的薄層色譜鑒別

2.1.1 栓菌酸的薄層色譜鑒別 取樺褐孔菌藥材粉末（過四號篩）1 g，加異丙醇20mL，超聲（頻率45 kHz，功率400 W）處理20 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇3 mL使溶解，作為供試品溶液。取栓菌酸對照品，加甲醇制成質量濃度為0.5 mg/mL的對照品溶液。按照2020年版《中國藥典》（四部）通則0502薄層色譜法，吸取上述供試品溶液10 μL、對照品溶液5 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲苯-乙酸乙酯-甲醇（體積比為10∶4∶1∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴5%磷鉬酸乙醇溶液，在105 ℃條件下加熱至斑點顯色清晰。結果顯示，供試品溶液色譜在與對照品溶液色譜相應位置上顯相同顏色的斑點。結果見圖1。

圖1 樺褐孔菌藥材中栓菌酸的薄層色譜圖

2.1.2 樺褐孔菌醇的薄層色譜鑒別 按照“2.1.1”項下方法制備供試品溶液。取樺褐孔菌醇對照品，加甲醇制成質量濃度為0.5 mg/mL的對照品溶液，作為對照品溶液。按照2020年版《中國藥典》（四部）通則0502薄層色譜法，吸取上述供試品溶液10 μL、對照品溶液5 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以二氯甲烷-甲苯-乙酸乙酯-甲醇（體積比為10∶4∶0.3∶0.3）為展開劑，展開，取出，晾干，噴5%磷鉬酸乙醇溶液，在105 ℃條件下加熱至斑點顯色清晰。結果顯示，供試品溶液色譜在與對照品溶液色譜相應位置上顯相同顏色的斑點。結果見圖2。

圖2 樺褐孔菌藥材中樺褐孔菌醇的薄層色譜圖

2.2 樺褐孔菌藥材的HPLC指紋圖譜研究

2.2.1 色譜條件 色譜柱為Agilent 5 TC-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為乙腈（A）-水（B），梯度洗脫（0～12 min，90%A→95%A；12～15 min，95%A；15～16 min，95%A→100%A；16～39 min，100%A；39～40 min，100%A→90%A）；流速為1.0 mL/min；柱溫為30 ℃；檢測波長為203 nm；進樣量為20 μL。

2.2.2 溶液的制備 （1）供試品溶液的制備。取樺褐孔菌藥材粉末（過四號篩）2 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入三氯甲烷20 mL，密塞，超聲處理30 min；放冷，濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇溶解，轉移至5 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，過0.45 μm微孔濾膜，取續濾液，即得供試品溶液。（2）對照品溶液的制備。取栓菌酸、樺褐孔菌醇、麥角甾醇、羊毛甾醇對照品適量，精密稱定，加甲醇溶解并定容，制成上述成分質量濃度分別為368.84、201.02、390.37、285.76 μg/mL的單一對照品溶液。精密吸取各單一對照品溶液2、5.5、0.5、2 mL，置于同一10 mL容量瓶中，混勻，過0.45 μm微孔濾膜，取續濾液，即得栓菌酸、樺褐孔菌醇、麥角甾醇、羊毛甾醇質量濃度分別為73.77、110.56、19.52、57.15 μg/mL的混合對照品溶液。

2.2.3 精密度考察 取供試品溶液（S3號樣品），按照“2.2.1”項下色譜條件重復進樣6次，記錄色譜圖。以樺褐孔菌醇為參照峰，計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結果表明，各共有峰的相對保留時間RSD均小于0.49%，相對峰面積RSD均小于3.99%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.2.4 穩定性考察 取供試品溶液（S3號樣品）于室溫放置0、2、4、8、12、24 h時，按照“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。以樺褐孔菌醇為參照峰，計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結果表明，各共有峰的相對保留時間RSD均小于0.88%，相對峰面積RSD均小于2.89%（n＝6），表明樣品溶液在室溫放置24 h內穩定。

2.2.5 重復性考察 精密稱取S3號樺褐孔菌藥材粉末2 g，按“2.2.2”項下方法平行制備供試品溶液6份，按照“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。以樺褐孔菌醇為參照峰，計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結果表明，各共有峰的相對保留時間RSD均小于0.75%，相對峰面積RSD均小于4.06%（n＝6），表明方法重復性良好。

2.2.6 HPLC指紋圖譜的建立 取22批樺褐孔菌藥材粉末2 g，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。將22批樺褐孔菌藥材的色譜圖導入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012版）》進行分析。選取S17號樣品作為參照圖譜，時間窗寬度設為0.1 min，經多點矯正，生成樺褐孔菌藥材的HPLC疊加指紋圖譜和對照指紋圖譜。另外，取“2.2.2”項下混合對照品溶液適量，按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。結果顯示，22批樺褐孔菌藥材共有10個共有峰；與混合對照品色譜圖對比后，指認出3號峰為栓菌酸，4號峰為樺褐孔菌醇，9號峰為麥角甾醇，10號峰為羊毛甾醇。結果見圖3、圖4。

圖3 混合對照品溶液HPLC色譜圖

圖4 樺褐孔菌藥材HPLC疊加指紋圖譜

2.2.7 相似度評價 采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012版）》計算22批樺褐孔菌藥材HPLC圖譜的相似度。結果顯示，與對照指紋圖譜相比，各批樺褐孔菌藥材樣品圖譜的相似度在0.942～0.995之間，表明各批樣品間相似度良好。

2.3 樺褐孔菌藥材的化學模式識別分析

2.3.1 聚類分析 以22批樺褐孔菌藥材指紋圖譜中10個共有峰峰面積為參量，采用SPSS 23.0軟件進行聚類分析，采用組間平均數聯結法，以平方歐氏距離為度量標準進行聚類，并繪制樹狀圖（圖5）。結果顯示，當平方歐氏距離＞10時，22批樺褐孔菌樣品可以分為兩類，其中S1～S15、S19、S21、S22聚為第1類，S16～S18、S20聚為第2類。該聚類分析結果提示，樺褐孔菌藥材間存在一定差異。

圖5 22批樺褐孔菌藥材的聚類分析樹狀圖

2.3.2 主成分分析 為綜合評價不同批次間樺褐孔菌藥材質量的差異，將22批樣品10個共有峰的峰面積作為原始數據，采用SPSS 23.0軟件進行主成分分析。以特征值＞1為標準，共得到3個主成分，其特征值分別為5.927、1.711、1.318，對總方差的累積貢獻率為89.522%，說明這3個主成分可以反映22批樺褐孔菌藥材大部分的信息，提示樺褐孔菌藥材的質量差異是由多種化學成分共同引起的。由表2可知，主成分1可以反映共有峰2、3（栓菌酸）、4（樺褐孔菌醇）、6、7、10（羊毛甾醇）的信息，主成分2可以反映共有峰1、9（麥角甾醇）的信息，主成分3可以反映共有峰5、8的信息。

表2 主要因子載荷矩陣

以上述3個主成分對22批樺褐孔菌藥材進行綜合評價，參考文獻[7]方法，計算主成分得分：Z1＝-0.185x1+0.212x2+0.060x3+0.212x4+0.114x5+0.196x6+0.091x7-0.088x8-0.065x9+0.316x10；Z2＝0.508x1-0.057x2+0.188x3-0.054x4-0.087x5-0.025x6+0.154x7+0.006x8+0.384x9-0.253x10；Z3＝0.058x1+0.019x2+0.142x3-0.008x4+0.351x5-0.052x6+0.089x7+0.629x8-0.184x9-0.288x10。其 中，Z1、Z2、Z3代表主成分1、2、3的得分值；x1～x10代表主成分因子的10個共有峰峰面積標準化的數值。根據各主成分的貢獻率與3個主成分總貢獻率之比計算權重系數[8]，再計算主成分綜合得分（Z綜）：Z綜＝59.267/89.522×Z1+17.108/89.522×Z2+13.178/89.522×Z3，主成分綜合得分越高說明質量越好[9]，結果見表3。結果顯示，主成分綜合得分排名前4位的樣品分別為S17、S18、S16、S20。

表3 22批樺褐孔菌藥材主成分得分和綜合得分

將22批樺褐孔菌藥材10個共有峰峰面積導入SIMCA14.1軟件繪制主成分得分圖（圖6）。結果顯示，S16～S18、S20樣品可與其他樣品區分開，說明這4批樣品與其他樣品存在差異，且與聚類分析結果相印證。

圖6 22批樺褐孔菌藥材主成分得分圖

2.3.3 正交偏最小二乘法-判別分析 為更好地考察引起不同批次樺褐孔菌藥材質量差異的主要標志性成分，筆者以22批樺褐孔菌藥材指紋圖譜共有峰峰面積為變量，進一步采用正交偏最小二乘法-判別分析對樣品進行分析。結果顯示，建立的正交偏最小二乘法-判別分析模型中，累計解釋能力參數R2X和R2Y分別為0.953和0.918，預測能力參數Q2為0.869，均大于0.5，提示本研究所建模型的穩定性及預測能力較好。設置分類矩陣變量隨機排列200次做置換檢驗，所得R2和Q2截距值分別為0.167、-0.751（均小于置換檢驗模型右上方的真實R2和Q2值），說明建立的正交偏最小二乘法-判別分析模型不存在過度擬合現象，可用于判別分析[10]。變量重要性投影（variable importance in projection，VIP）值是篩選差異性化合物的重要指標，值越大，表明該色譜峰的貢獻越大[11]。以VIP值大于1為標準，篩選出4號峰（樺褐孔菌醇，VIP值＝1.86）、3號峰（栓菌酸，VIP值＝1.62），7號峰（VIP值＝1.27）可能是影響不同批次間樺褐孔菌質量的標志性成分。

3 討論

3.1 薄層色譜鑒別時提取溶劑和展開劑的選擇

樺褐孔菌藥材薄層色譜鑒別時，分別考察了不同提取溶劑（甲醇、異丙醇、三氯甲烷）對藥材提取效果的影響。結果發現，以三氯甲烷為提取溶劑時，其對栓菌酸、樺褐孔菌醇的薄層色譜斑點有干擾；以甲醇為提取溶劑時，其對栓菌酸、樺褐孔菌醇的提取效果較差，薄層色譜斑點不清晰；以異丙醇為提取溶劑時，其對栓菌酸、樺褐孔菌醇的提取效果較好，薄層色譜斑點清晰無干擾，故本實驗采用異丙醇為提取溶劑。另外，本實驗還考察了石油醚（60～90 ℃）-乙酸乙酯、三氯甲烷-乙酸乙酯-乙醚、二氯甲烷-甲苯-甲酸-甲醇、三氯甲烷-甲苯-乙酸乙酯-甲醇等不同展開劑對栓菌酸、樺褐孔菌醇分離的影響。結果發現，以三氯甲烷-甲苯-乙酸乙酯-甲醇（體積比為10∶4∶1∶1）為展開劑時，栓菌酸的分離效果較好，比移值適中，斑點清晰；以二氯甲烷-甲苯-乙酸乙酯-甲醇（體積比為10∶4∶0.3∶0.3）為展開劑時，樺褐孔菌醇的分離效果較好。

3.2 HPLC指紋圖譜研究時提取溶劑及色譜條件的選擇

在制備供試品溶液時，筆者考察了異丙醇、甲醇、三氯甲烷等提取溶劑對樺褐孔菌藥材HPLC圖的影響。結果發現，采用極性較大的甲醇、異丙醇為提取溶劑時，雜質峰較大，且栓菌酸等成分色譜峰的響應較差；以三氯甲烷為提取溶劑時，雜質峰較小，特征色譜峰數量增多，響應更強，且更易于識別，故本實驗采用三氯甲烷為提取溶劑。

本實驗比較了不同流動相（甲醇-水、乙腈-0.1%磷酸溶液、乙腈-水）對各色譜峰分離的影響。結果發現，以乙腈-水為流動相時，各色譜峰峰形尖銳，分離效果較好。另外，通過全波長掃描發現，當檢測波長為203 nm時，HPLC圖可最大程度化地反映各色譜峰的信息，故本研究選擇203 nm作為檢測波長。

3.3 化學模式識別分析

本研究將22批樺褐孔菌藥材的HPLC指紋圖譜與化學模式識別分析相結合，以評價其質量。結果顯示，聚類分析可將22批樺褐孔菌藥材聚為兩類，即S16～S18、S20為一類，其余樣品為另一類；進一步由主成分綜合得分可知，S16～S18、S20這4批樣品的綜合得分排名靠前，表明這4批樣品質量較好。經筆者前期觀察也發現，這4批樣品質地堅硬沉重，菌肉顏色較深，而綜合得分較低的藥材質地輕泡松軟，顏色較淺，這提示樺褐孔菌藥材質量可能與質地色澤存在一定相關性。研究表明，在樺褐孔菌的生長過程中，其色澤由淡黃逐漸變成深褐色[12]。但由于樺褐孔菌均為野生，無法實現規模化的人工栽培[3]，故無法推知其具體生長年限。因此，后續可將樺褐孔菌藥材菌肉顏色和質地作為其質量評價依據。本研究采用正交偏最小二乘法-判別分析篩選出3個影響樺褐孔菌藥材質量的標志性成分，分別為樺褐孔菌醇、栓菌酸及色譜峰7所代表的化學成分。研究表明，樺褐孔菌醇具有抗腫瘤、抗氧化、抗炎等藥理作用[13—14]，栓菌酸具有抗炎、抗腫瘤、抗胃潰瘍、降糖、神經保護等藥理作用[15—16]。因此，后續研究可將上述3種成分作為樺褐孔菌藥材質量控制的評價指標。

綜上所述，本研究成功建立了樺褐孔菌藥材的薄層色譜鑒別方法及HPLC指紋圖譜，結合化學模式識別分析可為樺褐孔菌藥材的質量控制提供參考。