宏基因組二代測序技術在社區獲得性肺炎中的臨床應用體會

秦睿君，王虹，李虹，李慧芳

(太原市中心醫院，山西 太原 030009)

社區獲得性肺炎是呼吸內科最常見的疾病，可由病原微生物、理化因素、免疫損傷、過敏、藥物等多種原因引起，但臨床上導致肺炎最為常見的因素仍是病原微生物感染[1-3]。自然界病原微生物多種多樣，患者感染后的臨床癥狀、影像學特征及預后千差萬別，輕癥可短期康復，重癥則可能會導致死亡，所以盡快明確感染的病原體，做到精準治療，始終是臨床醫務工作者亟待解決的問題。目前傳統的檢測技術包括形態學檢查(涂片)、分離培養、免疫學等多種方法，但是由于耗時長、陽性率低、特異性差等原因，對于指導臨床實踐有很大的局限性。隨著基因組學的發展，宏基因組二代測序技術(mNGS)逐漸被運用于病原體診斷中。mNGS利用高通量測序得到的數據與病原體數據庫進行比對，可以在短時間內對樣本進行包括病毒、細菌、真菌和寄生蟲的全方位檢測，從而在核酸水平上精準鑒定病原體，因此在傳統檢測技術難以或無法檢測的病原體診斷方面具有極大的優勢[4]。本研究采用回顧性分析方法，對傳統培養法和mNGS進行比較，以期更好地指導臨床實踐。

1 資料與方法

1.1 一般資料

回顧性分析2020年12月—2021年12月我院呼吸與危重癥醫學科住院治療的26 例社區獲得性肺炎患者的臨床資料，其中男17 例，女9 例；重癥15 例(57.7%)，平均年齡74 歲，非重癥11 例(42.3%)，平均年齡60 歲；臨床表現為咳嗽、咳痰及呼吸困難等呼吸疾病癥狀者21 例，發熱者20 例；臨床結局死亡5 例，治愈20 例，轉院1 例。本研究過程符合我院倫理委員會要求，所有患者進行纖維支氣管鏡檢查及高通量二代基因測序時均簽署檢查同意書。

1.2 納入與排除標準

納入標準：所有患者的診斷符合中國成人社區獲得性肺炎診斷和治療指南(2016年版)中社區獲得性肺炎和重癥肺炎的診斷標準。社區獲得性肺炎的診斷標準：第一，社區發病。第二，肺炎相關臨床表現：新近出現的咳嗽、咳痰或原有呼吸道疾病癥狀加重，伴或不伴膿痰、胸痛、呼吸困難及咯血；發熱；肺實變體征和(或)聞及濕性啰音；外周血白細胞>10×109/L或<4×109/L，伴或不伴細胞核左移。第三，胸部影像學檢查顯示新出現的斑片狀浸潤影、葉或段實變影、磨玻璃影或間質性改變，伴或不伴胸腔積液。符合第一、第三以及第二中任何1 項，并排除肺結核、無炎癥性肺部腫瘤、非感染性肺間質性疾病、肺水腫、肺不張、肺栓塞、肺嗜酸粒細胞浸潤癥及肺血管炎等后，可建立臨床診斷。重癥肺炎的診斷標準：符合下列1 項主要標準或≥3 項次要標準者可診斷為重癥肺炎。主要標準：需要氣管插管行機械通氣治療；膿毒癥休克經積極液體復蘇后仍需要血管活性藥物治療。次要標準：呼吸頻率≥30 次/min；氧合指數≤250 mmHg(1 mmHg≈0.133 kPa)；多肺葉浸潤；意識障礙和(或)定向障礙；血尿素氮≥7.14 mmol/L；收縮壓<90 mmHg，需要積極的液體復蘇。

排除標準：不符合上述診斷標準的患者。

1.3 方法

根據患者病情收集其住院期間咽拭子、痰液，病情允許時行電子支氣管鏡檢查采集肺泡灌洗液(BALF)，共計26 份，其中咽拭子3 份，痰液9 份，肺泡灌洗液14 份，采集過程符合標本采集操作流程，每份標本均分為2 份，一份常規送檢我院檢驗科微生物室行微生物培養、鑒定，另一份外送予果生物科技(北京)有限公司行宏基因組高通量二代測序鑒定病原微生物。

1.3.1 微生物培養及鑒定

按常規方法進行分離培養，使用德國布魯克質譜儀進行菌種鑒定，使用VITEK-2 Compact全自動細菌培養鑒定藥敏分析儀(法國生物梅里埃公司)進行藥敏分析，根據美國臨床實驗室標準協會2019年規定的標準進行試驗和結果判讀。

1.3.2 宏基因組高通量二代測序

標本進行無菌密封，于-20 ℃儲存或干冰冷鏈物流運輸至予果生物科技(北京)有限公司，按照DNA提取、文庫構建，在Illumina平臺上運行宏基因組二代測序，然后進行數據分析。首先對下機數據進行質控分析，過濾掉原始數據中低質量序列和短序列(<35 bp)，得到高質量測序數據，再運用SNAP軟件去除人源序列，最后通過Burrows-Wheeler，與微生物基因組數據庫進行比對，從而對序列分類、鑒定。

1.4 統計學方法

采用SPSS21.0軟件包對數據進行統計學分析。計數資料以百分率(%)表示，用χ2檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 傳統微生物培養和mNGS檢出結果比較

共收集26 份標本，采用傳統微生物培養法，獲得13 份陽性報告，單病種感染9 例，混合感染4 例。檢出細菌病原體包括：醋酸鈣不動桿菌、銅綠假單胞菌、溶血葡萄球菌、瓊氏不動桿菌、肺炎克雷伯菌；真菌病原體包括：白色念珠菌、光滑念珠菌、熱帶念珠菌、酵母樣菌、構巢曲霉菌?；旌细腥镜? 例標本分別是醋酸鈣不動桿菌合并光滑念珠菌感染、肺炎克雷伯菌合并白色念珠菌感染、銅綠假單胞菌合并光滑念珠菌和白色念珠菌感染以及銅綠假單胞菌合并熱帶念珠菌感染。

mNGS法檢出23 份陽性結果，包括細菌20 種，真菌7 種，病毒9 種以及寄生蟲1 種。細菌常見檢出病原體是鮑曼不動桿菌、屎腸球菌及Actinomyces graevenitzii；真菌常見檢出病原體是白色念珠菌和耶氏肺孢子菌；病毒中比較常見的是人類皰疹病毒4型和1型。mNGS在絕大多數樣本中(21/26)檢出兩種以上的病原體，細菌、病毒及真菌三者共同檢出9 例。此外，3 例患者mNGS結果為陰性，其相應的傳統微生物培養病原學檢測同樣為陰性(見表1)。

表1 傳統微生物培養法和mNGS病原體檢出情況比較 單位：例

2.2 傳統微生物培養法和mNGS的診斷效能比較

26 例臨床確診為肺炎的患者，傳統微生物培養法共檢出13 份陽性，13 份陰性；mNGS共檢出23 份陽性，3 份陰性。mNGS靈敏度(88.5%)高于微生物培養靈敏度(50.0%)，差異有統計學意義(P=0.007)(見表2)。另外，重癥肺炎患者mNGS(93.3%)和微生物培養(60.0%)的敏感性均高于非重癥患者組(81.8%，36.4%)。

表2 兩種方法病原體檢出陽性情況比較 單位：例

2.3 典型病例

病例1，男性，78 歲，主因“血糖升高3年，發熱2 d”收住我院內分泌科。既往有冠狀動脈粥樣硬化性心臟病病史20 余年。入院后體溫波動于38.5℃～39.8℃，胸部CT示右肺上葉后段、下葉感染性病變，部分實變，先后給予頭孢他啶、左氧氟沙星、美羅培南等抗生素治療，治療1 周后體溫無下降，遂轉入我科繼續治療。我們考慮到患者高齡，病情危重，故給予全面覆蓋抗球菌、桿菌、病毒的治療方案(美羅培南、萬古霉素和奧司他韋)，同時行支氣管鏡檢查，將肺泡灌洗液送檢mNGS，2 d后結果回報檢出病原體Actinomyces graevenitzii，序列數為358 條，同時檢出鸚鵡熱衣原體，序列數為183 條，兩者置信度都判讀為高。結合患者臨床資料，該患者最終診斷為鸚鵡熱衣原體肺炎，遂將治療方案調整為多西環素治療，1 周后患者治愈出院。

病例2，男性，50 歲，主因“間斷咳嗽、咳痰1個月，加重伴氣緊15 d”入院。既往體健，胸部CT示兩肺彌漫性磨玻璃滲出，入院后患者呼吸困難明顯，氧合指數102，給予經鼻高流量氧治療，血氧濃度波動于75%～82%，考慮患者病情危重，經驗性給予美羅培南、萬古霉素、更昔洛韋和氟康唑治療，后化驗回報患者人類免疫缺陷病毒(HIV)可疑陽性，遂聯合復方磺胺甲噁唑治療，為達到精準治療，將痰液送檢mNGS，2 d后結果回報病原體為人型支原體，序列數2 055 條，耶氏肺孢子菌，序列數6 595 條，白色念珠菌，序列數666 條，三者置信度都判讀為高；人巨細胞病毒，序列數14 條，人類免疫缺陷病毒Ⅰ型，序列數3 條，兩者置信度都判讀為中。結合患者臨床資料，最終診斷為HIV，耶氏肺孢子菌肺炎同時合并支原體、白色念珠菌、人巨細胞病毒感染，遂將治療方案降階梯，給予復方磺胺甲噁唑、氟康唑和更昔洛韋治療，患者治愈出院。

3 討 論

社區獲得性肺炎是最常見的呼吸系統疾病，由于環境污染、人口老齡化、伴有基礎疾病以及免疫功能低下等多種原因導致其發病率、病死率居高不下，特別是重癥肺炎，病死率極高。如何盡快明確病原體，由經驗治療轉為精準治療，始終是臨床工作中的難題。臨床通常依靠傳統的微生物培養法明確病原體，但是該類檢查方法檢出率低，耗時長，特別是對于危重患者，經常難以獲得合格的標本，微生物培養陽性率更低，陽性結果的參考價值也同樣降低。隨著生物技術的不斷發展，mNGS技術越來越多地運用于呼吸道感染疾病的診治中。由于它的高時效、高檢出率，可以在短時間內無偏倚地對標本中全部核酸信息進行測序，因此在明確感染病原體方面有著明顯的優勢。2018年，加利福尼亞大學Langelier等[5]評估mNGS檢測下呼吸道感染病原菌的能力，基于致病菌核酸序列、氣道微生物組、宿主表達基因3個層面，成功在26 例下呼吸道感染患者中檢測出全部38 種致病病原體以及升高10倍以上的氣道微生物，實現對下呼吸道感染的準確診斷，也為有效區分定植菌與致病菌提供了參考。同年，Miao等[6]發表了迄今中國mNGS臨床應用樣本量最大的回顧性研究：共納入511 份標本，其中包括感染病例347 例，非感染病例119 例和未明確病例45 例。結果顯示，mNGS診斷肺部感染性疾病的靈敏度和特異度分別為50.7%和85.7%，均優于傳統培養法，尤其在結核分枝桿菌、病毒、厭氧菌和真菌檢測方面優勢更加明顯。Shi等[7]在評估110 例可疑肺結核感染的研究中，最終臨床診斷肺結核48 例，非結核感染62 例，mNGS檢測靈敏度為47.92%，與X-pert (45.83%)和培養法(46.81%)相似，高于抗酸染色法(29.17%)。Li等[8]應用mNGS對20 例肺組織樣本中的病原菌進行了回顧性研究，其中15 例樣本中檢出致病菌，涵蓋了傳統方法難以檢出的苛養菌和厭氧菌，同時與培養法相比，mNGS檢測細菌的靈敏度和特異度分別是100%和76%。Xie等[9]對178 例重癥肺炎患者的回顧性研究發現，將mNGS檢測結果作為輔助診斷依據調整治療方案，可顯著提高患者28 d和90 d生存率。mNGS的另一個重要特征是可以檢出既往少見的、難以檢測的病原體，更新了我們對特殊肺炎的認知。

本研究回顧性分析收集的26 例肺炎患者臨床資料，經過統計學比較，mNGS法靈敏度及符合率均明顯高于傳統微生物培養法。本研究中病例1采用mNGS技術確診鸚鵡熱衣原體肺炎，并及時調整治療方案，治愈出院。此外我們還利用mNGS技術診斷出5 例耶氏肺孢子菌肺炎，給予精準治療后患者好轉出院，進一步證明宏基因組高通量二代測序技術在診斷特殊病原體肺炎方面有極大的優勢。但是在研究中我們也發現，采用mNGS檢測，混合感染居多，具體是何種病原體導致發病，仍需要我們結合臨床認真分析，如大部分標本中均可找到人類皰疹病毒，該病毒是一種雙鏈DNA病毒，超過90%的成人已經被感染并有病毒抗體，其是否屬于真正的致病病原體需要結合臨床等多種資料共同分析。此外還有1 例病例，mNGS技術檢出毛霉菌，序列數僅為1，置信度為中，但患者以咳嗽、咳痰、發熱就診，病情短期內快速進展，并出現咯血，雖給予抗球菌、桿菌、病毒等聯合治療，但效果差，在mNGS結果回報前即臨床死亡，結合患者病史、影像等資料，最終考慮毛霉菌為致病菌。該病例也同樣提示我們對于測序結果的判斷必須結合臨床。目前我們研究的樣本量仍較少，所獲取的信息有局限性，高通量測序技術在呼吸道感染疾病的應用價值仍有待進一步評估，包括結果的判讀、耐藥基因的檢測，仍需要技術的不斷改進和深入研究。