卵母細胞中線粒體相關內質網膜結構與功能的研究進展

戴王娟，覃蓮菊，崔毓桂，劉嘉茵

(南京醫科大學生殖醫學國家重點實驗室，南京醫科大學第一附屬醫院生殖醫學中心，南京 210029)

隨著現代社會醫學的進步，人類預期壽命自上世紀起開始逐漸增加，但在女性絕經時間與生殖潛能的保持方面，并沒有出現同步改善的趨勢。當女性年齡超過35歲，其卵巢儲備功能開始下降，并伴隨卵母細胞的質量、數量下降以及異常胚胎發生率及流產率明顯升高。但我們目前對生殖衰老的機制仍不清楚[1]。

卵母細胞是影響卵子受精及發育成胚胎的核心環節之一，其數量的減少以及質量的下降是造成女性不孕的重要因素。卵母細胞不同于體細胞，承擔著提供大量胚胎發育所需的母源性物質的重要角色，其成熟依賴充足而穩定的能量來源保障，而這種保障的基礎是線粒體作為“能量工廠”功能的正常發揮[2]。Ca2+作為細胞重要的第二信使，通過調控線粒體內三羧酸循環中關鍵酶的活性，對ATP生成具有重要意義。研究證實，當線粒體Ca2+攝取不足會導致能量產生障礙，而線粒體Ca2+過載也會引起線粒體膜電位下降，繼而誘發線粒體功能障礙[3-4]。因此，卵母細胞中Ca2+傳導是胞質成熟的基礎之一。

線粒體Ca2+攝取的主要來源是作為鈣儲庫的內質網。內質網通過與線粒體外膜耦聯，形成“系繩”樣結構，持續穩定地傳輸Ca2+，這一特殊結構被稱為線粒體相關內質網膜(Mitochondrial associated membrane，MAM)[5]。目前有關MAM介導的線粒體Ca2+攝取異常在一些衰老疾病模型(如神經退行性病變、心肌衰老等)中有所研究，但在生殖系統領域尚未見大篇幅研究報道。本文將通過綜述MAM的結構組成、相關蛋白組分與功能，重點闡述MAM與卵母細胞成熟與發育之間的關系，并介紹相關研究的最新進展。

一、MAM的結構與功能

從形態學而言，MAM并非一個特化出的固定結構。MAM的形成更多的是依賴于線粒體外膜與內質網膜膜間距而形成的一個動態結構[6]。當兩種細胞器的膜間距處于一個合適的范圍時(目前研究者多認為應<100 nm)，MAM即可能形成[7]。Poston等[8]對MAM進行了蛋白組學的鑒定，報道了存在于MAM的1 212個候選蛋白，并揭示了其結構組成：位于內質網或線粒體膜上的Ca2+通道、脂質合成及轉移酶類、各種分子伴侶和連接蛋白。其中，定位于MAM介導Ca2+轉運的蛋白主要有內質網的1，4，5-三磷酸肌醇受體(IP3R)、線粒體外膜(Mitochondrial outer membrane，MOM)的電壓依賴性陰離子選擇性通道(Voltage-dependent anion channel，VDAC)和線粒體內膜(Mitochondrial inner membrane，MIM)的線粒體鈣離子單向轉運體(Mitochondrial calcium uniporter，MCU)。

雖然研究者們多將線粒體和內質網膜間距<100 nm的區域定義為MAM，但不同細胞類型中其膜間距也存在差異，如人類肝臟細胞中的線粒體和滑面內質網膜間距為10～15 nm，而粗面內質網因存有核糖體，此部位的MAM間距也較大，為20～30 nm。MAM的距離直接影響著線粒體Ca2+的攝取[9]。Csordas等[10]通過人工干預制造出的“人造連接”使MAM間距縮短，發現線粒體內Ca2+濃度明顯升高并繼發相關功能異常。但也有研究發現：若MAM距離<5 nm，線粒體也無法正常攝取鈣離子。這可能是由于MAM結構中IP3R通道的大量胞質結構域從滑面內質網膜表面凸起的高度約為10～12 nm，而MAM的間距過小可能會影響到IP3R的蛋白構象并繼而影響到其功能的正常發揮[11]。

關于MAM的研究目前多集中在衰老疾病。研究表明，MAM介入氧化應激、內質網應激、Ca2+超載、線粒體功能障礙、炎癥、細胞凋亡等多個疾病發生、發展過程[12]。鑒于卵母細胞衰老及功能障礙可能也和MAM的功能異常密切相關，因此有研究者已經開始相關領域的探索，其具體內容綜述如下。

二、MAM與卵母細胞中氧化應激

氧化應激/活性氧簇(ROS)誘發凋亡在女性生殖衰老的病理生理進程中發揮關鍵作用。隨著年齡增長，機體各系統中均存在ROS增加及抗氧化防御能力降低現象。生理狀態下，ROS在卵母細胞的發育中發揮著細胞內信號傳導的作用——適量活性氧雖可增強卵母細胞的發育潛能，但ROS異常升高亦可加速卵母細胞老化[13]。在卵泡內，由卵母細胞和體細胞形成的微環境中，ROS對卵母細胞的影響主要表現為細胞核DNA斷裂、細胞皺縮、細胞膜空泡化以及凋亡小體的生成并最終啟動細胞死亡。內質網和線粒體是ROS產生的兩大來源，而MAM是兩者ROS交換發生的地方[14]。因此，MAM結構與功能的穩定是影響ROS代謝的關鍵。研究發現，許多細胞氧化狀態的調節因子就位于內質網-線粒體聯結處，其中包括66 kD的Shc蛋白(p66Shc)。p66Shc是線粒體中通過產生ROS促進哺乳動物衰老的氧化還原酶，通常被認為是導致年齡相關功能障礙的促進因子。MAM中的p66Shc水平及線粒體中ROS的產生隨年齡增大而增加[15-16]。RNA依賴的蛋白激酶樣內質網激酶(PERK)是未折疊蛋白反應(Unfolded protein response，UPR)中的關鍵內質網應激感受器，也在MAM處富集，通過Ca2+和ROS轉移促進內質網和線粒體之間的功能交流，PERK缺陷的細胞表現出內質網形態和Ca2+穩態失調，影響ROS從內質網向線粒體的轉移，細胞隨之發生內質網應激并走向凋亡[17]。

三、MAM與卵母細胞中內質網應激

卵泡生長是通過卵母細胞大小的增加伴隨周圍顆粒細胞(Granule cells，GCs)的增殖來實現的。Monniaux等[18]發現，進入次級卵泡期后，隨著卵母細胞生長和GCs增殖速率逐漸增加，卵母細胞及其微環境會出現缺氧現象，進而誘導內質網應激和UPR。研究發現，在內分泌和旁分泌作用下，機體會從同時發育的多個卵泡中選擇一個優勢卵泡，并將其他卵泡閉鎖，這種卵泡的選擇性發育機制可能與內質網應激有關[19-21]。

干擾細胞內Ca2+儲存可激活內質網UPR。毒胡蘿卜素(一種Ca2+-ATP酶抑制劑)可降低細胞內Ca2+濃度并導致UPR通路激活。不僅如此，增加細胞內Ca2+水平也可誘導UPR通路，例如離子霉素就可以通過上調細胞內的Ca2+濃度誘導UPR的發生，并引起Bip/Grp78表達的增加[22]。

MAM中鈣網蛋白(Calreticulin)、鈣結合蛋白(Calnexin)是調控和保障內質網蛋白正確折疊的關鍵因子，而Calreticulin或Calnexin功能的發揮依賴于Ca2+的激活。當內質網Ca2+儲存濃度下降，影響蛋白質的正確折疊，導致錯誤折疊蛋白蓄積和UPR激活[23-24]。內質網應激感受器蛋白Ero1-α作為氧化折疊和內質網氧化還原狀態的關鍵控制器，位于MAM，其表達增加會促進IP3R激動劑作用下從內質網到線粒體的被動Ca2+外流，導致線粒體鈣超載后引發細胞凋亡[25]。以上研究均表明，MAM結構中定位于內質網膜的相關蛋白可通過Ca2+信號傳導影響內質網應激，也間接影響了卵泡發育中卵母細胞的發育和成熟。

四、MAM與卵母細胞中線粒體應激

1.線粒體的能量代謝與凋亡：MAM最重要的功能之一就是促進線粒體Ca2+攝取，調控氧化代謝及凋亡，這一功能對卵母細胞發育中線粒體ATP合成的累積及細胞凋亡具有重要意義[26-27]。Pinton等[28]觀察到神經酰胺處理的HeLa細胞中的Ca2+從內質網釋放并進入線粒體，造成線粒體鈣超載，細胞器隨后發生腫脹、斷裂，與細胞色素C(Cyto C)釋放同步發生；而降低內質網Ca2+的釋放可阻止上述損傷性變化。也有研究發現，體外培養條件下，老化的卵母細胞胞漿內持續高Ca2+狀態會誘導鈣調蛋白依賴激酶Ⅱ(Calmodulin-dependent protein kinase Ⅱ，CaMKⅡ)的活化，活化的CaMKⅡ可激活Wee1并誘導CyclinB1降解以及Cdk1的Thr14/Tyr15磷酸化，進而導致成熟促進因子(Maturation-promoting factor，MPF)不穩定，而持續低水平的MPF則會誘導體外培養的卵母細胞發生凋亡[29]。

抗凋亡蛋白Bcl-2是第一個被證實通過調控線粒體內Ca2+來抑制凋亡的蛋白。研究發現，Bcl-2蛋白大量富集于MAM區域，通過與IP3R相互作用抑制其Ca2+通道活性，阻止線粒體攝取過多Ca2+，進而抑制細胞凋亡[30-31]。也有研究顯示，在老化的卵母細胞中，持續的MPF降低或者氧化應激增加都會引起Bcl-2家族成員Bax過表達和Bcl-2的低表達，導致線粒體膜上Bax/Bcl-2比率改變和繼發的膜電勢改變，促使卵母細胞內CytoC增加，誘導細胞凋亡[32]。

2.線粒體的融合與分裂：近期研究者們發現在評估線粒體功能的時候，除了mtDNA拷貝數以及線粒體ATP的生成外，線粒體的動態能動性也是不容忽視的環節。研究發現，線粒體可通過瞬時的線粒體融合進行功能互補，此現象被形象地命名為“kiss and run”[33-34]。這為基于線粒體功能評估卵母細胞胞質成熟水平提供了新的視角。有研究發現，線粒體在融合與分裂過程中受到了MAM結構中融合相關蛋白MFN1、MFN2和分裂相關蛋白DRP1的調控[35]。Zhang等[36]研究顯示，線粒體分裂嚴格依賴于Ca2+，線粒鈣超載后引發DRP1向線粒體外膜的募集，進而通過水解GTP引起自身構象變化，促進線粒體分裂，過度的線粒體分裂則會導致線粒體氧化呼吸功能損傷以及誘發凋亡。Cherubini等[37]發現，亨廷頓舞蹈癥突變小鼠模型的紋狀體內異常的DRP1積聚會誘發線粒體斷裂，迫使線粒體遠離內質網，破壞內質網-線粒體的耦聯，繼而導致Ca2+外流障礙和線粒體超氧化物的過度產生。在生殖系統領域，Zhang等[38]研究發現，MFN2基因敲除小鼠可出現嚴重的發育延遲，并且因胎盤缺陷導致胚胎死亡，對卵母細胞特異性敲除該基因后會導致雌性小鼠不孕；研究還發現，卵母細胞中MFN1缺失會引起卵母細胞-顆粒細胞通訊受損，鈣粘蛋白和連接蛋白下調，從而導致卵泡發育停滯在次級卵泡階段，引起與卵母細胞成熟障礙相關的不孕。Hou等[39]通過對敲除了MFN2基因的卵母細胞研究發現，MFN2基因缺失的卵母細胞表現出端粒縮短、細胞凋亡增加和線粒體功能障礙，導致卵母細胞質量受損和卵泡耗竭加速，與卵巢儲備功能減退表型一致。

五、總結

在過去的幾十年中，“以線粒體為中心”的觀念逐漸受到“細胞器間通訊”概念的挑戰。過去人們以為，細胞關鍵生命活動的調節，如細胞的代謝和死亡，可能僅僅以線粒體自主的方式發生；而現在研究者逐漸發現，盡管線粒體在細胞生命活動的各個方面起著舉足輕重的作用，而對細胞命運至關重要的生命活動則更多依賴于線粒體與內質網動態建立的相互作用。正因如此，MAM現在被越來越多地認為是分子信號交換和蛋白質復合物形成的一個關鍵細胞功能平臺，調控著各種細胞生命活動，其中當然也包括Ca2+介導并參與的卵母細胞發育成熟過程。