陳皮中黃酮的提取分離純化方法*

谷雪賢

(中山火炬職業技術學院健康產業學院，廣東 中山 528436)

陳皮分為陳皮和廣陳皮，是我國傳統中藥材之一，其中廣陳皮作為廣東省江門市新會區的地理標志特色產物。陳皮中含有黃酮、生物堿、揮發油等活性成分。其中揮發油主要成分為檸檬烯，別名苧烯，屬于單萜類化合物，化學式C10H16，是一種天然的功能單萜，因為其有獨特的香味，在食品、化妝品中可作香精香料；黃酮類物質具有良好的抗氧化功效，是一種具有藥用價值的天然綠色成分，對陳皮中黃酮類化合物提取及其活性研究一直是陳皮研究的熱點，目前已從該屬植物中分離和鑒定的黃酮類化合物多達六十多種，主要包括：橙皮苷、新橙皮甙、柑橘素、二氫川陳皮素及5-去甲二氫川陳皮素等。其中橙皮苷含量最高，被2015版藥典定義為陳皮的指標性成分，要求其含量不得低于3.5%[1]。

近10年內眾多學者通過各種實驗方法在各種植物中提取黃酮類化合物，其中使用得最多的方法是超聲波法，微波反應器輔助法，CO2超臨界流體法，有機溶劑熱回流法，靜態浸泡法等；分離純化方法主要有大孔樹脂吸附法、層析法、制備高效液相色譜法等，定性定量分析方法主要包括紫外分光光度法、高效液相色譜法及液相色譜——質譜聯用技術等。

1 陳皮中黃酮混合液的提取方法

1.1 堿性水提取法

由于黃酮化合物分子結構中苯環上的羥基，使其具有親水和酸度，所以能在弱堿水中溶解。常用氫氧化鈉稀溶液浸泡提取植物中的黃酮類物質。焦鐳等[2]驗證：用pH值為8.5，液料比25∶1 mL/g，溫度為90 ℃的條件下提取3 h可得山楂葉總黃酮的提取量為7.97 mg/g。

1.2 有機溶劑提取法

用石油醚、乙酸乙酯、乙醇、甲醇等有機溶劑提取陳皮中的黃酮是實驗室中最常見的方法，其主要原因是黃酮苷元難溶或不溶于水，易溶于有機溶劑。但該方法采用的有機溶劑大多都對人體有害，并可造成環境污染，同時提取過程中因采用了加熱工藝，可能破壞其有效成分。

鐘桂云等研究了乙醇提取陳皮中黃酮含量的影響因素，結果表明主要的影響因素有乙醇和水的比例、料液比、溫度、提取次數及提取時間，其中乙醇和水的比例對提取率的影響很大，乙醇濃度高能促進黃酮的提取。經實驗確定提取黃酮的最佳工藝條件為： 乙醇和水的比例為4∶1 (體積比)、料液比1∶30、提取溫度75 ℃、提取時間2.5 h，在此條件下提取率為0.75%[3]。吳昊等[4]利用響應面法對陳皮黃酮的提取工藝進行了優化，在料液比為1∶30(g/mL)，乙醇濃度為70%，提取溫度為73.2 ℃，提取時間為2.25 h的最佳工藝條件下，黃酮得率實測值為2.02%。吳迪[5]通過單因素實驗證明提取陳皮中的黃酮化合物最適溶劑是乙醇，其次是甲醇，提取率最低的是水溶液，并用乙醇熱回流法提取了陳皮中的黃酮類化合物，確定了8倍量60%乙醇回流提取3次(時間分別為1.5 h、1.0 h、0.5 h)為最佳工藝條件，總黃酮提取率為0.1351 mg/g。逢顯娟等[6]采用溶劑熱法提取陳皮中的橙皮苷，其最佳提取工藝條件為，提取溫度120 ℃，乙醇濃度60%，液料比70∶1 mL/g，提取時間45 min，橙皮苷得率為6.07%±0.03%。比傳統的乙醇回流法提取時間縮短了近70%，橙皮苷得率約提高1倍。

宋玉鵬等以丙酮-石油醚-水(6∶5∶5)為溶劑體系，采用簡單、高效的多溶劑萃取法，從陳皮三氯甲烷萃取部分粗提物中分離得到純度高于98%的川陳皮素和橘皮素[7]。

1.3 纖維素酶預處理聯合熱回流提取法

陳皮中的黃酮等大部分有效成分都被包裹在其細胞壁內，為了獲取為獲取目標成分，必須破壞其細胞壁，植物細胞的細胞壁主要成分為纖維素，而纖維素酶能夠有效地破壞纖維素的β-1，4糖苷鍵，從而破壞纖維素的結構，進而提高有效成分的提取收率[8]。

2017年張利等利用響應面法優化了纖維素酶提取陳皮中橙皮苷的工藝條件，結果顯示最佳工藝條件為：加酶量=0.79%、pH=3.45、T=59.07 ℃、t=2.13 h，此條件下預測橙皮苷得率為4.15%。比傳統乙醇工藝提取橙皮苷得率提高了11.32%[9]。

2022年劉謙鴻等[10]利用纖維素酶預處理聯合熱回流提取法對陳皮中橙皮苷進行提取，其提取工藝為：首先將陳皮粉碎過0.150 mm孔徑篩、然后用纖維素酶進行預處理、隨后加入乙醇進行熱回流提取。確定了最佳工藝條件為：(1)纖維素酶預處理：pH 4.8、溫度45 ℃、酶解時間1.5 h、酶∶陳皮粉的質量比1∶30，(2)熱回流提取：溫度85 ℃、乙醇體積分數70%、提取時間3 h、料液比1∶25(g/mL)。在此條件的處理下，橙皮苷提取率為5.99%。一定程度地提高橙皮苷提取率，降低了污染。

1.4 超聲波輔助提取法

超聲提取法也是用于陳皮中黃酮類成分提取的常用方法之一，這是因為超聲具有空化、熱、力學等效應。在空化過程中，微泡的爆炸將會產生巨大的壓力，從而在一瞬間引起植物細胞壁的破裂，利用植物的內液釋放，從而減少了細胞內液體的溶解。破壞陳皮的細胞膜，促進黃酮等成分的釋放。

鄭美玲等利用超聲波法提取了陳皮中的黃酮，確定了最佳工藝條件為料液比1∶30，乙醇體積分數80%，提取時間 20 min。在此條件下，陳皮黃酮的提取率為1.467%[11]。韓鵬虎等用均勻設計優化了超聲波輔助提取陳皮總黃酮的工藝，最終確定乙醇的體積分數為70%、料液比為1∶20(g/mL)、超聲時間為30 min為其最佳工藝條，此條件下陳皮總黃酮提取率為0.55%[12]。蘇學軍等[13]利用表面活性劑協同超聲提取了陳皮中的總黃酮，在最佳提取工藝下提取率可達6.83%，其中表面活性劑為質量分數為0.5%的Tween20、乙醇的濃度為60%、料液比為1∶50(g/mL)、溫度為70 ℃。何露等[14]用超聲波輔助溶劑提取法提取了陳皮黃酮類化合物，設計響應面法對其提取工藝進行了優化，當乙醇質量分數為60%，超聲時間為36 min，料液比為1∶25(g/mL)，所得黃酮提取率為24.75 mg/g，并且黃酮提取液用乙酸乙酯萃取和AB-8樹脂純化后，其抗氧化能力在純顯著增強，抗氧化能力的順序為：AB-8 樹脂純化>乙酸乙酯萃取>純化前。

1.5 微波輔助提取法

趙珉等[15]對比了純水、堿水和乙醇三種不同溶劑對微波提取法提取率的影響，最終確定了最佳的提取溶劑為乙醇，提取率為2.268%。黃智等[16]研究采用微波輔助提取陳皮中橙皮苷的最優工藝條件：料液比1∶50、微波時間40 s、微波功率為240 W，在該條件下橙皮苷的提取為8.12%±0.04%。王慧芳等[17]依據單因素實驗建立BBD實驗模型，用響應面優化了微波輔助乙醇法提取陳皮中總黃酮的工藝，實驗結果表明當乙醇體積濃度為60%、微波功率為619 W、時間為3 min、提取溫度為62 ℃、料液比 1∶21(g/mL)時的黃酮得率最高，為1.3468%±0.0142%。

1.6 超臨界萃取法

超臨界流體萃取利用超臨界流體為萃取劑多選用CO2，將原料中的黃酮化合物提取出來。超臨界CO2萃取法具有提取工藝簡單、操作條件溫和、提取效率高、無有機溶劑殘留等優點，并且還有利于熱不穩定成分存在，使其生物活性成分不易發生改變，因此適用于黃酮化合物的提取。羅歡等采用正交試驗法優選了超臨界CO2萃取陳皮中川陳皮素和橘皮素的工藝，確定了最佳的萃取工藝條件為：t=2 h，T=35 ℃，P=30 MPa，流速u=20 kg/h，萃取率達1.96%，川陳皮素和橘皮素總含量為45.23 mg/g[18]。

油田的概念同時具有空間和類型兩方面的涵義。就三維空間而言，油氣的聚集應位于一定的地區、特定的地質單元的特定層系。就類型而言分類的方法很多，如業內常把是否能以傳統方式打井直接開采而分為常規和非常規，以生儲油組合的地層特點分海相和陸相等領域。在我們討論的問題中新區一般指沒有或僅有少量油田的一個較大的地區/地質單元（例如西藏高原、南黃海），新領域是指沒有或僅有少量油氣發現的勘探新層系、新類型。在實際工作中新區、新領域二者可有一定程度的交叉重疊。

除上述的四種萃取方法外，黃酮類化合物提取的方法還有多種，但是每種方法都各有不同的優缺點，因此，在選取最佳的萃取工藝時，應綜合考慮原料性質、成本、設備等方面的因素，最終選擇最為合適的提取方法。在實際操作中，為了提高黃酮化合物的的得率，一般會采用多種提取方法相結合的方式。

2 陳皮中黃酮的分離純化方法

2.1 柱色譜法

柱色譜法是一種具有樣品處理量大、分離速度快、分離效率高成本低等優點的高效的物理分離方法[19-21]。楊潔等[22]從陳皮80%乙醇的提取物中利用硅膠、ODS柱層析色譜法和重結晶分離純化得到了12個單體化合物，其中8個是PMFs(多氧甲基黃酮)，首次從陳皮中分離得到了 8-羥基-3，5，6，7，3′，4′-六甲氧基黃酮和5，4′-二羥基-3，6，7，8，3′-五甲氧基黃酮。Fu等[23]采用硅膠柱色譜、Sephadex LH-20與ODS柱層析法相結合的方式，從陳皮中分離得到了9中聚甲氧基黃酮成分。呂小健等[24]先用無水乙醇浸提、然后依次用正己烷和二氯甲烷萃取得到了陳皮粗提物，再以硅膠做吸附劑，乙酸乙酯-石油醚做洗脫劑，分離得到了高純度的川陳皮素和橘皮素。

2.2 高速逆流色譜法

高速逆流色譜法具有上樣量大、分離效率高、產物純度高、回收率高等優點。孫印石等[25]采用高速逆流色譜法，以 2∶4∶3∶3的石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水為溶劑體系，從陳皮粗產物中一步分離制備得到了桔皮素、5-羥基-6，7，8，3′，4′-五甲氧基黃酮，純度均達到97.0%以上。鄭國棟等[26]利用高速逆流色譜法，以1∶0.8∶0.7∶0.8的石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水為溶劑體系，從300 mg廣陳皮乙酸乙酯粗提物中一次性制備分離得到了川陳皮素、3，5，6，7，8，3′，4′-七甲氧基黃酮和橘皮素，其純度分別為96.25%、97.10%、99.22%。

2.3 大孔樹脂吸附法

大孔樹脂吸附法是利用特殊的吸附劑與陳皮中的黃酮所產生的范德華引力或氫鍵作用，實現對黃酮的吸附分離，然后再通過選擇合適的溶劑將吸附在吸附劑上的黃酮物質洗脫下來，實現黃酮組分的富集。

劉韶等[27]篩選陳皮中多甲氧基黃酮類的大孔樹脂純化工藝，比較了D101型和DM130型大孔樹脂對陳皮中多甲氧基類黃酮的吸附效果，結果表明D101型大孔樹脂為較佳的吸附樹脂，經過處理后川陳皮素和橘皮素的純度分別提高了3.7倍和3.2倍。

王惠芳等[28]考察了HPD-100、HP-20、AB-8、X-5、NKA-Ⅱ五種大孔樹脂對黃酮的靜態吸附及其解吸作用并篩選了最佳吸附脫附條件，實驗結果表明HP-20大孔樹脂最適合分離純化陳皮中的黃酮，在最佳工藝條件為下黃酮回收率達64.95%。

3 陳皮提取物中化學成分定性與定量分析的方法

目前，陳皮中黃酮類化合物的定性定量分析方法主要有紫外分光光度法、高效液相色譜法和高效液相色譜-質譜聯用等。因為紫外分光光度法的專屬性較差，所以應用并不廣泛。HPLC法具有分析快速，分離高效，檢測靈敏等特點，王健芬[29]利用HCLP法測定橙皮苷含量，平均回收率分別為100.90%和99.25%，RSD分別為0.16%和1.20%高效液相色譜法在黃酮類化合物含量測定方面的應用較多。

王文昌等[30]利用超高效液相色譜法快速測定了陳皮及其提取物中蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷4種黃酮類化合物的含量，與常規方法不同的主要是其流動相的組成，該方法中使用的流動相為17∶83的乙腈-1%乙酸溶液，實驗結果表明精密度和準確度均較好。

李穎詩[31]UPLC-Q-TOF-MS 技術，通過對得到的高分陳皮提取物的高分辨飛行時間質譜總離子流色譜圖進行分析，最終鑒定出50個化學成分，其中主要成分為甲氧基黃酮及其同分異構體物質。

4 結 語

陳皮作為中國的傳統中藥材之一中含有豐富的黃酮的物質并且組成復雜，目前研究較多的仍是混合黃酮成分的提取，而對高效且適于工業化的分離純化方法研究較少，而如果要對陳皮中黃酮物質的具體化學組分、結構研究及其活性進行深入研究仍需對其分離純化方法、工藝以及定性定量分析方法等進一步研究優化。