血液中乙醇測定影響因素探討

張棲瀝

(玉溪明鏡司法鑒定中心，云南 玉溪 653100)

血液中乙醇的測定，經歷不斷地發展和完善，目前常用于司法鑒定機構中的方法是頂空-氣相色譜法。頂空-氣相色譜法，是在氣相色譜儀進樣口前增加一個頂空進樣裝置(分為手動和自動)的一種色譜技術，也常被解釋為將頂空進樣器與氣相色譜儀聯用的儀器。其工作原理是以氣體作為流動相，樣品由微量注射器“注射”進入進樣器，氣化后被載氣攜帶進入填充色譜柱或毛細管柱。由于樣品中各組分在色譜中的流動相(氣相)和固定相(固相)間分配或吸附系數的差異，各組分在兩相間做反復多次分配，使各組分在柱中得到分離，在色譜柱后的檢測器將各組分按順序檢測出來。頂空氣相色譜分析相比普通色譜分析主要有以下優點：一、廣泛使用，范圍更廣。既可分析液體樣品中的揮發性組分，也能分析固體樣品中的揮發性物質；既適用于單組分揮發性氣樣的分析，也能對組成復雜的揮發性組分混合物進行分離分析；既能用于常量頂空氣樣分析，又能檢測低含量的揮發性組分。二、快速簡便、進樣準確。頂空氣相色譜分析直接取液體樣品(或固體樣品)的揮發性氣態樣品送進氣相色譜儀進行分離分析。在很多情況下，可以省去樣品前處理操作，人為干擾因素少，故此法要比普通的色譜分析更為快速簡便。另外，由于采用定量管進樣，分析更準確。三、低檢測限、重現性好。頂空氣相色譜分析有時還可獲得比普通氣相色譜分析更低的檢測限，這是因為避開了常規樣品前處理過程中所帶來的溶劑干擾、以及頂空樣品的某些特殊性的緣故。其由于壓力平衡自動進樣，重現性更好。由于頂空-氣相色譜儀分析具有獨特的優越性，因此，在食品科學、環境科學、材料科學、生化科學分析領域中，得到了廣泛的應用。我國公安部發布的行業標準GA/T 1073-2013《生物樣品血液、尿液中乙醇、甲醇、正丙醇、乙醛、丙酮、異丙醇和正丁醇的頂空-氣相色譜檢驗方法》[1]和GA/T 842-2019《血液酒精含量的檢驗方法》[2]中對血液中乙醇的測定就是通過使用頂空-氣相色譜法，以乙醇的保留時間或相對保留時間進行定性，采用內標法或外標法定量，從而完成對液中乙醇的定性定量測定。

1 血液中乙醇測定影響因素

1.1 色譜柱分析系統的影響

氣化后的樣品在色譜柱種中被分離，隨載氣進入檢測器。因此。色譜柱是氣相色譜儀的核心部件，合理地選擇色譜柱是建立較佳的色譜分析方法的中心環節。

色譜柱一般分為：填充柱和毛細管柱兩大類型。填充柱通常柱長1～3 m，內徑3～6 mm，一般短柱用玻璃管，長柱用不銹鋼管。毛細管柱是用玻璃或熔融石英拉制成毛細管的色譜柱。柱長20～50 m，內徑0.1～0.5 mm。相對于填充柱來說，毛細管柱一般具有更高的分離效能，這是因為：(1)毛細管柱孔徑小，內壁固定液膜極薄，中心是空的，故阻力很小，而且渦流擴散項不存在，譜帶展寬變小。由于毛細管柱的阻力很小，其長度可為填充柱的幾十倍，其總柱效比填充柱高得多。(2)毛細管柱的分析速度約為填充柱的數十倍。由于液膜極薄，分配比k很小，相比大，組分在固定相中的傳質速度極快，因此有利于提高柱效和分析速度。(3)柱使用壽命長。當然，毛細管柱也有其局限性。因其內徑小，柱容量小，且對進樣技術的要求更高，所以載氣流速的控制要求更為精確。進樣量越小，意味著對檢測器的靈敏度要求就更高。因此，在血液中乙醇檢測的氣相色譜系統中，常用的色譜柱為毛細管色譜柱，檢測器為FID檢測器(火焰離子化檢測器)。在GA/T 1073-2013《生物樣品血液、尿液中乙醇、甲醇、正丙醇、乙醛、丙酮、異丙醇和正丁醇的頂空-氣相色譜檢驗方法》和GA/T 842-2019《血液酒精含量的檢驗方法》氣相色譜檢測參考條件中，DB-ALC1和DB-ALC2就是血液中乙醇分析中常用的超高惰性色譜柱，在很長一段時間內都能保持良好的重現性與穩定性。

1.1.1 單柱與雙柱的定性

采用頂空-氣相色譜法(單柱單檢測器)進行血液中乙醇含量檢測時，當存在與乙醇(如鹵代羥基烷類吸入用全身麻醉劑)具有相似色譜行為的化合物時，在某些特定的色譜條件下，此類化合物的保留時間會和乙醇的保留時間相近，進而導致色譜峰重合，最終會對檢測的結果形成干擾，此時將無法對陽性結果進行準確有效的甄別[3]。當定性無法準確甄別判定時，就可能導致假陽性的定性，對當事人造成不利影響，進而讓辦案機關對鑒定機構的鑒定質量產生質疑。

通過改變色譜柱、柱溫、載氣流速等氣相色譜檢測條件，可在一定程度上排除此類干擾物對乙醇定性分析的影響。因此，使用區分效能充足的雙色譜柱和雙FID檢測器系統進行血液中乙醇含量檢測是定性判定的關鍵因素，雙柱雙檢測器的氣相色譜系統可以顯著降低假陽性判定的發生率，從而最終達到保障檢測機構公信力的目的。

1.1.2 雙柱存在定量差異

在日常檢測工作中，血液中乙醇的定量方法通常采用內標法(主要為內標工作曲線法)。即在一系列不同濃度對照品溶液中加入相同內標物，分別測定其峰面積，以對照品峰面積與內標物峰面積的比值對對照品溶液濃度作線性回歸，求出線性回歸方程或繪制工作曲線，最終測定檢材的待測物的濃度。檢測過程中若出現干擾物，尤其是干擾物與內標物保留時間相近，此時便會造成內標物與干擾物未良好分離，從而導致內標峰面積受到影響，最終造成雙柱的定量結果有較大差異。2016 年，文迪等[4]在對兩例血液乙醇含量檢測中，均檢出了丙酮成分，丙酮與叔丁醇的保留時間重合導致內標峰面積增加。2019年，許龍慧等[5]在對一例血液乙醇含量檢測中，檢出未知干擾物，干擾物與叔丁醇的保留時間重合導致內標峰面積增加。當內標峰面積增加，最終會使乙醇測定值降低，對乙醇定量結果產生干擾。因此，在檢測過程中，還應該特別注意未知干擾物對檢測體系的影響。雙柱雙檢測器是提高氣相色譜系統抗干擾能力有效方法(其中前文提到的DB-ALC2由于獨特的極性，對于關鍵的乙醇/丙酮峰，比其它血液乙醇確證毛細管柱有更高的分離度)，通過雙柱雙檢測器系統，可以及時發現內邊峰面積的異常變化，除此之外，檢測機構在日常工作中，需要經常關注容易產生假陽性的有關化合物和干擾物的相關文獻報道，有條件的機構還可以通過氣相色譜質譜聯用法對未知干擾物進行定性的確證分析。

1.2 血液樣本的采集和保存條件的影響

1.2.1 血液采集前處理

在采集血液前的消毒過程中，如果抽血人員使用了含有乙醇類的消毒劑時，并且在消毒劑未揮發前便進行采血，可能導致提取的血液受到外來乙醇污染，并最終引發血液中乙醇的定量結果異常升高的問題[6]。因此采集血液樣本時，皮膚消毒劑宜使用不含醇類的聚維酮碘、0.1%苯扎氯銨溶液、0.1%苯扎溴銨溶液、1.0%醋酸氯己定溶液、雙氧水(20%)及不含乙醇的碘伏溶液，不應使用含醇類或其他揮發性有機物的消毒劑[7]，徹底避免血液的假性升高問題。

1.2.2 血液采集部位

真空靜脈采血由于在全封閉的系統下進行，而且真空采血管蓋帽密封性較好、膠塞中間有凹槽，這樣從根本上減少了血液受到接觸污染的機會，降低了血液樣本污染、溶血、凝血的發生，因此，活體的血液采集一般都選擇體表淺靜脈的真空采血。但是在有人員傷亡的交通事故或者因酗酒導致乙醇中毒的死亡案件中，由于人體在死亡后，身體代謝機能停止，胃內的乙醇會彌散到鄰近的器官，當彌散發生后，此時各器官組織內的乙醇含量會存在明顯的差別。采集不同器官組織部位的血液，最終的乙醇定量結果也會不同。因此，在抽取尸體血液時，為了防止乙醇彌散所帶來的影響，此時需要首選股靜脈或鎖骨下靜脈血液采集；溺死尸體因液體進入肺內，心血被稀釋，亦應采周圍血；對于損傷嚴重或殘缺的尸體，在無法提取到股靜脈或鎖骨下靜脈血液時，則可選擇心臟包腔血液[7]。

1.2.3 血液的保存

(1)血液儲存容器

謝春等[8]研究發現，不同儲存容器對血液中乙醇濃度均有影響。普通采血管的乙醇濃度高于真空普通管，而真空普通管的乙醇濃度又高于真空抗凝管。造成乙醇濃度有差異的原因是：真空抗凝管能使血液保持在真空封閉的狀態，避免了乙醇的揮發、阻止了抗凝管內外物質的交換，并且因為抗凝劑的添加，有效防止了血液發生凝固。使用普通采血管、甚至促凝劑管采集的血樣，由于采血管內未添加抗凝劑，血漿中的纖維蛋白原轉變為不溶的纖維蛋白，血細胞聚集從而形成血凝塊。當血液發生凝固后，此時采血管內的固相便會增加、而相對應的液相便會減少，最終導致血樣中乙醇含量檢測結果比抗凝管的結果高，因此真空抗凝管是血液中乙醇測定中樣本儲存的最佳容器。而在常見的真空抗凝管中，當抗凝劑的種類不同時，因為抗凝管自身所含的液體體積會有差異，所以采集血樣后，不同種類抗凝劑對血液的稀釋作用也會有差異，最終導致血樣中乙醇含量定量結果也會有差異。涂國章等[9]研究發現EDTA-K2采血管作為儲存容器時，其血液乙醇含量檢測結果的準確性最好。因此，道路交通執法人員為了確保血液乙醇檢測結果的準確性，最好采用EDTA-K2采血管來儲存涉嫌酒駕的的人員的血樣，并按相關規定送檢。

(2)采血管的保存條件

血樣在保存過程中，會因溫度和時間而發生不同程度的自溶、腐敗、揮發、氧化等問題，不同溫度及時間對保存血液的有效期和質量均有影響，隨溫度的升高，血液保存時效將會縮短，血液質量將因損傷加強而下降，同一時期內血液保存損傷作用隨溫度的降低而減輕[10]，所以血液乙醇含量檢測必須控制好合適的血樣保存溫度以確保血液質量在有效的檢測時間內不發生變化，從而保證檢測結果的準確性。涂國章等[11]研究的4個溫度保存條件中，14天內保存可在4～8 ℃冰箱冷藏，較長時間則在-20 ℃冰柜保存對血液乙醇含量檢測影響較小。因此，執法機構在按照規定抽血后需要低溫保存并及時送檢，檢測機構在受理委托后，需要及時鑒定，不能及時鑒定的也必須低溫直立保存。

1.3 腐敗尸體血

人體死亡后，在適當的溫度、濕度和空氣氣流條件下，組織蛋白質會在人體內的微生物(主要是腐敗細菌)的作用下發生腐敗分解，從而發生尸體腐敗。尸體腐敗會伴隨產生乙醇、正丙醇、正丁醇等多種產物，且隨著時間延長，腐敗程度會加重。尤其是超過一天的尸體，不可忽視死后組織腐敗產生的乙醇量。針對死后腐敗血液中乙醇含量測定，需要綜合考慮死者生前的飲酒史以及是否患有糖尿病，避免血液腐敗后的自生醇現象對乙醇含量測定結果分析產生干擾[12]。劉兆等[13]研究發現腐敗尸體中生成的正丙醇和乙醇具有相關性，尸體在產生乙醇的同時，會平行地產生正丙醇，如果血中乙醇含量在正丙醇的20倍以內，可以認定是死后產生的乙醇；如超過此值，則系生前飲酒的標志。但是隨著研究的不斷深入，正丙醇已不能作為血液中乙醇系腐敗產生的唯一依據，其作為腐敗尸體中乙醇生成濃度的指標價值變得越來越有限。禹明筠等[14]研究表明，尸體血樣腐敗產生的乙醇不能導致 EtG (乙基葡萄糖醛酸苷)或 EtS (乙基硫酸酯)的產生。因此，血樣中的 EtG 和 EtS 可作為判斷尸體血樣中乙醇生前入體和死后產生的依據，從而避免由于較高濃度的自生乙醇而導致乙醇認定的假陽性結果。除此之外，腐敗尸體也可取玻璃體液測定乙醇含量(玻璃體液的乙醇含量在尸體腐敗后一段時間內仍能保持穩定，血液與玻璃體液乙醇濃度的比例系數是0.98)。

1.4 檢測機構日常質量控制

在實際的檢測過程中，日常的質量控制是檢測機構最基本同時也是最重要的一個環節。一、檢測人員除了要具備最基本的相關專業知識和檢測能力以外，還得不斷學習新的專業技能，做到與時俱進，并且按時進行考核。二、檢測機構按照規范要求配備好相應的檢測設備后，在進行檢測工作前，必須要對相應的設備進行校準檢定，保證設備能夠達到相對應的校準檢定的規范要求達到的準確性和重復性，并制定期間核查計劃和設備維護計劃。三、檢測機構需要定期查新血液中乙醇測定的檢驗規范和要求，通過實驗室間比對或者能力驗證考核，優化好設備的儀器參數條件。四、制備曲線時候所用到的標準品(不同濃度的乙醇標準樣品)一定得選擇有質檢證書的國家級別的標準物質，且標準品在有效期內，這樣才能保證曲線的有效性及準確性。五、檢驗檢測的環境條件需要滿足相關的標準要求，同時環境條件的記錄需要真實和及時。檢測結果會受到檢測人員、分析儀器、檢測方法和技術、檢材質量、實驗室環境等影響而產生一定的誤差，產生檢測結果的不確定度。血液中乙醇含量檢測的不確定度主要來于檢材重復性檢測、乙醇標準曲線和氣相色譜儀的誤差[15]。因此檢測機構的日常質量控制，是一項系統、復雜但是又基本、關鍵的工作，為了保證檢測結果的準確性，檢測機構應該重視日常的質量控制管理工作。

2 結 論

在司法鑒定中，血液中乙醇濃度測定的鑒定意見被視為醉駕案件審判的重要證據之一，其鑒定意見的合法性、真實性、準確性將會直接影響辦案機關審判的公平公正，同時在酒駕醉駕案件處理、處罰及量刑上起著決定性作用。因此，檢測機構在日常的血液中乙醇檢測工作中，通過識別并規避血液中乙醇測定中的不利影響因素，可有效提高血液中乙醇測定結果的準確性，提高其司法鑒定意見的證據價值。