腦膠質瘤中MAGE-D4和MCM3 mRNA的表達水平及其臨床意義

張鵬博,張 沅,李冰瀅,謝 歡,李 鑫,陳 芳,農蔚霞,,羅 彬,,,謝小薰,,,張慶梅,,(山西省運城市中心醫院神經外二科,運城 0000;廣西醫科大學組織學與胚胎學教研室;廣西醫科大學基礎醫學研究重點實驗室;廣西醫科大學長壽與老年相關疾病教育部重點實驗室;通訊作者,E-mail:90785@qq.com)

膠質瘤是一種常見的原發性神經上皮腫瘤，約占中樞神經系統所有腫瘤的35%，占成人原發性惡性腦腫瘤的75%[1]，目前其常規治療主要包括手術切除、替莫唑胺(TMZ)化療和放療，但這些還遠不能達到對膠質瘤的完全治愈，只能作為緩解其發展的手段[2]，迫切需求尋找新的治療手段。腫瘤免疫療法是一種新型的治療方法，其主要目的是提高抗腫瘤免疫反應，比化療等直接殺死癌細胞的藥物脫靶效應小，腫瘤免疫治療的主要障礙之一是確定最適合使用的腫瘤靶抗原。

黑色素瘤抗原基因(melanoma-associated antigen genes, MAGE)是近年來發展迅速的腫瘤分子靶點，1991年Bruggen等[3]發現MZ2-E(現稱為MAGE-A1)是一個編碼腫瘤特異性抗原的基因，此后根據基因結構和組織特異性基因表達的差異，已經鑒定出80多個MAGE基因，并將其分為Ⅰ型和Ⅱ型基因。與Ⅰ型基因相比，Ⅱ型MAGE-D基因具有更復雜的基因組結構，具有一個由多個外顯子編碼的開放閱讀框。MAGE-D4屬于MAGE-Ⅱ家族，已經有多項研究發現MAGE-D4在膠質瘤中特異性表達,并且其表達水平相比正常腦組織呈現過表達[4,5]，提示MAGE-D4可能在膠質瘤中是腫瘤特異性抗原。

本課題組前期通過沉默膠質瘤細胞株中MAGE-D4的表達，顯示其可抑制膠質瘤細胞株的惡性生物學行為[6]，并進一步通過RNA-Seq高通量測序，觀察到沉默MAGE-D4的表達可引起微小染色體維持蛋白3(minichromosome maintenance 3，MCM3)的表達明顯下降。為了分析MAGE-D4和MCM3在膠質瘤中的關聯性及其臨床意義，本研究采用了基因表達譜交互式分析(Gene Expression Profiling Interactive Analysis，GEPIA)數據庫、癌癥基因組圖譜(The Cancer Genome Atlas，TCGA)、中國腦膠質瘤基因組圖譜計劃(The Chinese Glioma Genome Atlas，CGGA)、逆轉錄-定量聚合酶鏈反應(reverse transcription-quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR)和小干擾RNA(small interfering RNA, siRNA)技術相結合的方式分析MAGE-D4和MCM3在膠質瘤組織及細胞中的表達水平，及其臨床意義和相關性，探索二者是否共同參與了膠質瘤的發生、發展。

1 材料與方法

1.1 在線數據庫分析

采用GEPIA數據庫(http://gepia.cancer-pku.cn)分析MAGE-D4和MCM3 mRNA在膠質瘤和正常腦組織中的表達，其中包括低級別膠質瘤518例，膠質母細胞瘤163例和正常腦組織207例；此外，分別下載TCGA及CGGA數據庫中675例及326例膠質瘤中MAGE-D4和MCM3 mRNA的生存資料，分析MAGE-D4和MCM3 mRNA的表達情況與患者預后總體生存率的相關性。

1.2 臨床資料與組織標本

本研究方案經廣西醫科大學附屬第一醫院醫學倫理委員會批準，納入本研究的所有患者均獲得書面知情同意。收集2009-2018年廣西醫科大學附屬第一醫院神經外科住院患者并接受手術治療的腦膠質患者組織標本62例和正常腦組織標本11例。根據WHO中樞神經系統腫瘤分類中低膠質瘤分類，Ⅰ級12例，Ⅱ級26例，Ⅲ級12例，Ⅳ級12例。將Ⅰ～Ⅱ級膠質瘤歸為低級別膠質瘤(low-grade gliomas, LGG)，Ⅲ～Ⅳ級膠質瘤歸為高級別膠質瘤(high-grade gliomas, HGG)。病理檢查結果：星型細胞瘤41例，膠質母細胞瘤(GBM)12例，少突膠質細胞瘤5例，室管膜瘤4例。所有膠質瘤患者在術前均未接受放療及化療。作為陰性對照的正常腦組織標本11例，來自于腦外傷后去骨瓣減壓過程中去除的正常腦組織。膠質瘤標本選取腫瘤中心組織，盡量避開出血及壞死部位，離體后立即置入液氮罐中并迅速轉運到-80 ℃冰箱保存。通過醫院病歷系統收集膠質瘤患者的一般臨床資料及病理檢查結果。

1.3 主要試劑

人腦膠質瘤細胞株U251和SF126均購自中國科學院上海細胞培養庫，培養細胞所用的胎牛血清、青-鏈霉素混合液、MEM-EBSS培養基及DMEM培養基均購于南京維森特生物技術有限公司，轉染試劑LipofectamineTM3000購自美國Thermo Fisher Scientific公司，RNA提取試劑盒、HiScript Ⅱ Q RT SuperMix for qPCR試劑盒購自美國Vazyme公司，超微量分光光度計購自天根生化科技有限公司，LightCycler480Ⅱ熒光定量PCR儀購自Roche公司,siRNA由上海吉瑪基因股份有限公司合成。

1.4 細胞培養

人腦膠質瘤細胞株U251和SF126培養于DMEM、MEM-EBSS培養基(含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 μg/L鏈霉素)中；培養條件為37 ℃，5%CO2。

1.5 細胞轉染

于6孔板中以3×105個/孔的細胞密度接種SF126及U251，37 ℃，5%CO2培養24 h，待融合度約70%時，開始進行轉染。轉染時首先將siRNA和轉染試劑LipofectamineTM3000混合形成轉染復合物，接著更換無血清培養基，并將靜置15 min，將轉染復合物加入6孔板中，混勻后置于細胞培養箱繼續培養24～72 h，培養完成后收集細胞進行沉默效率及最佳干擾時間檢測實驗，沉默效率實驗采用RT-qPCR對轉染前后細胞(U251，SF126)檢測MAGE-D4的表達，并計算沉默效率及最賤干擾時間。干擾MAGE-D4表達的siRNA和陰性對照siRNA(靶基因MAGE-D4的無關序列)的序列為：MAGE-D4 siRNA Sense:5′-GUGCAAUCGGAAAGCUACATT-3′,Antisense:5′-UGUAGCUUUCCGAUUGCACGC-3′;陰性對照siRNA Sense:5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′,Antisense:5′-CGUGACACGUUCGGAGAATT-3′。

1.6 RT-qPCR檢測MAGE-D4和MCM3 mRNA的表達

按照細胞/組織總RNA提取試劑盒說明書提取組織標本和膠質瘤細胞株總 RNA,接著利用超微量分光光度計及瓊脂糖凝膠電泳檢測上述提取RNA的濃度、純度及完整性；確定RNA完整無降解后，采用HiScript Ⅱ Q RT SuperMix for qPCR試劑盒將RNA逆轉錄為cDNA，得到的cDNA首先經過擴增管家基因檢測質量，采用LightCycler480Ⅱ熒光定量PCR儀進行擴增，以GAPDH為內參對照，每個樣品重復3個孔，整體實驗重復3次；上述反應體系為：SYBR Green Ⅰ Master 10 μl，ddH2O 7.2 μl，上、下游引物各0.4 μl，cDNA 2 μl；反應條件：95 ℃預變性30 s，95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，共40個循環；MAGE-D4、MCM3和GAPDH引物序列分別見參考文獻[7,8]。采用2-ΔΔCt法計算目的基因MAGED4和MCM3相對表達水平。RT-qPCR引物見表1。

表1 RT-qPCR引物序列Table 1 Primer sequences for RT-qPCR

1.7 統計學分析

上述MAGE-D4和MCM3的表達是以其mRNA的中位數將其分為高表達組和低表達組，并應用SPSS 27.0統計分析軟件進行數據分析，其中多組間的比較使用單因素方差分析，以SNK檢驗進行組間兩兩比較；MAGE-D4和MCM3 mRNA表達與臨床病理特征之間的關系使用卡方檢驗(Chi-square test)；表達相關性分析采用Pearson相關系數法，以P<0.05為差異有統計學意義，以上統計分析采用Graphpad Prism 9.0作圖。

2 結果

2.1 膠質瘤中MAGE-D4和MCM3的表達

GEPIA數據庫查詢結果顯示：與正常腦組織相比，MAGE-D4和MCM3 mRNA無論在低級別膠質瘤還是高級別膠質瘤組織中均呈高表達(P<0.05，見圖1)。檢測本實驗室所收集的62例膠質瘤樣本，RT-qPCR結果證實:膠質瘤組織中MAGE-D4表達為正常腦組織的3.95倍，且差異具有統計學意義(t=2.989,P=0.004<0.05)；膠質瘤組織中MCM3表達為正常腦組織的3.49倍，且差異具有統計學意義(t=2.294,P=0.025<0.05，見圖2)。

與正常腦組織比較,*P<0.05圖1 GEPIA數據庫中不同組織MAGE-D4和MCM3 mRNA的表達水平比較Figure 1 Comparison of MAGE-D4 and MCM3 mRNA expression levels in different tissues in GEPIA database

與正常腦組織比較,*P<0.05,**P<0.01圖2 腦膠質瘤組織與正常腦組織MAGE-D4和MCM3 mRNA表達水平比較Figure 2 Comparison of MAGE-D4 and MCM3 mRNA expression levels between glioma tissue and normal brain tissue

2.2 膠質瘤患者MAGE-D4和MCM3的生存分析

通過TCGA數據庫查詢顯示：MAGE-D4及MCM3在總體膠質瘤中表達與總體生存率明顯相關(P<0.001，見圖3)；接著通過在CGGA數據庫中查詢顯示：MAGE-D4在原發膠質瘤中的表達與總體生存率密切相關(P<0.05)，而在復發膠質瘤中MAGE-D4表達與總體生存率無明顯相關性；MCM3在原發及復發膠質瘤中均與總體生存率明顯相關(P<0.001，見圖4)。

圖3 TCGA數據庫中不同MAGE-D4和MCM3表達膠質瘤患者的生存分析Figure 3 Survival analysis of glioma patients with different MAGE-D4 and MCM3 expression in TCGA database

圖4 CGGA數據庫中不同MAGE-D4和MCM3表達的原發膠質瘤和復發膠質瘤患者的生存分析Figure 4 Survival analysis of primary and recurrent glioma patients with different MAGE-D4 and MCM3 in CGGA database

2.3 MAGE-D4和MCM3表達與膠質瘤患者臨床指標的關系

為了解MAGE-D4和MCM3在膠質瘤組織中表達的臨床意義，將MAGE-D4及MCM3 mRNA與膠質瘤患者臨床指標的關系進行統計分析，結果顯示：MAGE-D4及MCM3 mRNA的表達水平與患者年齡、性別、WHO分級、病理類型、卡氏評分(Karnofsky performance score, KPS)、腫瘤大小及Ki-67、膠質纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein, GFAP)、S-100和波形蛋白(vimentin)表達均無相關性(P>0.05，見表2)。

表2 MAGE-D4及MCM3 mRNA表達情況與膠質瘤患者臨床指標的關聯性分析結果 例(%)Table 2 Correlation between mRNA expression of MAGE-D4 and MCM3 and clinical indicators of glioma patients cases(%)

2.4 膠質瘤組織MAGE-D4與MCM3 mRNA表達相關性分析

Pearson相關分析結果顯示，所檢測的膠質瘤組織中MAGE-D4與MCM3 mRNA表達水平呈正相關(r=0.075 51，P=0.030 7，見圖5)。

圖5 膠質瘤樣本中MAGE-D4和MCM3的相關性分析Figure 5 Correlation between MAGE-D4 mRNA and MCM3 mRNA in glioma samples

2.5 膠質瘤細胞株沉默MAGE-D4表達對MCM3表達的影響

細胞實驗結果顯示，經MAGE-D4 siRNA沉默后,SF126細胞中沉默效率為57%，而且MCM3 mRNA的表達水平較沉默前顯著下降(P<0.05，見圖6)；U251細胞經MAGE-D4 siRNA沉默后，沉默效率為83%，MCM3 mRNA的表達水平同樣顯著下降(P<0.05，見圖6)。

與MOCK組比較，*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001圖6 膠質瘤細胞株沉默MAGE-D4表達后MCM3的表達Figure 6 Expression of MCM3 in glioma cell lines after silencing MAGE-D4 expression

3 討論

膠質瘤是中樞神經系統最常見的惡性腫瘤，其包括多種組織學類型，如星形細胞瘤、少突膠質細胞瘤、室管膜瘤和膠質母細胞瘤(GBM)，根據WHO分類可進一步分為4個級別。WHO Ⅰ和Ⅱ分級為生長緩慢且預后較好的病灶，也稱為低級別膠質瘤；而WHO Ⅲ級和Ⅳ級通常被認為是高級別膠質瘤，具有侵襲性行為和不良預后[9-11]。目前來說，癌癥免疫治療可以成為膠質瘤治療的一種新的方向，其可通過操縱免疫系統實現腫瘤的長期緩解，且副作用最小。篩選腫瘤特異性抗原正是開展腫瘤免疫治療的基礎。

MAGE家族是目前來說研究進展較快的一類腫瘤相關抗原，目前來說，有許多MAGE家族成員已被深入研究，并認為是理想的腫瘤靶抗原，如MAGE-A1、MAGE-A3、MAGE-A9等已在某些腫瘤中進入臨床試驗階段，并呈現出相對良好的療效[12,13]。因此，MAGE家族具有重大研究價值，本文中的MAGE-D4已有多項研究證實其在肺癌[14,15]、肝癌[16,17]、乳腺癌[18]等多種類型的腫瘤中高表達，并且有實驗已經開始對MAGE-D4進行多克隆抗體的制備[19]。有研究表明MAGE-D4表達下調可引起P53突變型膠質瘤細胞系的細胞周期S期和G2/M期細胞比例增加，表明MAGE-D4對細胞周期的影響可能依賴于P53[6]。本研究通過GEPIA數據庫數據及臨床實驗數據證實MAGE-D4在膠質瘤組織中呈高表達，而在正常腦組織中低表達或不表達，這與相關文獻報道結果相似[4,6]，并且通過CGGA及TCGA數據庫證實了MAGE-D4的表達與總體生存率有明顯的相關性，這些提示MAGE-D4在膠質瘤的發生發展過程中可能發揮重要作用。

腫瘤的發生及發展離不開體內、體外各種因素及多種基因間的相互作用。為了尋找與MAGE-D4相互作用的各種基因分子，本課題組前期通過RNA-seq高通量測序篩選發現了MCM3[20]。目前已知MCM3屬于微小染色體維持蛋白的一員。MCM3編碼808個氨基酸的核蛋白，分子量為105 kD[21,22]。以前的研究表明，MCMs蛋白復合物與DNA復制的起始和延伸有關[23]，MCMs被認為是細胞周期S期的特殊啟動標志蛋白，其可以在不同的細胞周期中大量表達，并在靜止、衰老和分化步驟中降解，因此MCMs可以用作組織中細胞周期狀態的特定標記蛋白[24]。MCMs基因在增殖細胞中的這一特征已導致其潛在的臨床應用作為癌癥篩查的標志物。有研究表明，MCM3s是一種P53結合蛋白[25]。同時有文獻指出，MCM3在多種腫瘤中過度表達,如腎細胞癌[26]、子宮內膜癌[27]、乳腺癌[28]、髓母細胞瘤[29]、惡性黑色素瘤[30]等。但MCM3在膠質瘤中的表達情況和作用機制國內外文獻研究并不多。本研究首先通過GEPIA數據庫數據及臨床實驗檢測證實MCM3在膠質瘤中高表達，接著通過CGGA及TCGA數據庫證實了MCM3的表達與總體生存率有明顯的相關性，這與文獻的研究結果類似[31,32]。但令人遺憾的是本研究結果并未觀察到MAGE-D4和MCM3 mRNA與膠質瘤患者臨床指標存在相關性，可能的原因有標本例數有限、臨床資料不夠完善等，可擴充樣本進一步實驗。

Pearson相關分析結果顯示，MAGE-D4與MCM3 mRNA表達水平呈正相關，差異具有統計學意義，并且沉默MAGE-D4 mRNA在膠質瘤細胞中的表達后，MCM3 mRNA表達水平隨之顯著下降，這提示MAGE-D4可能與MCM3之間存在相互作用，綜合上述結果及文獻分析，猜測MGGE-D4與MCM3可能通過p53信號通路共同參與對細胞周期的調節，從而參與了膠質瘤的發生、發展。

綜上所述，MAGE-D4和MCM3在膠質瘤組織中呈高表達，且二者表達水平呈正相關，可能共同參與了膠質瘤的發生、發展過程。MAGE-D4和MCM3具有成為膠質瘤免疫治療新靶點的潛力。