lncRNA HOTAIRM1通過(guò)miR-17-5p調(diào)控慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移

苗玉迪，高 瑛，侯麗敏，胡星星，張 虹，趙喬佳杰，魏旭倉(cāng)(陜西省人民醫(yī)院血液內(nèi)科，西安 7006；陜西省人民醫(yī)院血液病研究室；通訊作者,E-mail:miaoyudi6@6.com)

慢性粒細(xì)胞白血病(chronic myelocytic leukemia, CML)是一種起源于多能造血干細(xì)胞的造血干細(xì)胞腫瘤增生性疾病[1,2]，主要患病人群為中老年人[3]。雖然酪氨酸激酶抑制劑(tyrosine kinase inhibitors, TKI)如伊馬替尼對(duì)CML患者具有良好的治療效果，但仍有部分患者的治療效果不理想，復(fù)發(fā)率較高[4]。因此，仍需要開(kāi)發(fā)新型CML治療靶點(diǎn)。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是一類長(zhǎng)度在200個(gè)核苷酸(nt)以上但缺乏蛋白編碼功能的RNA。其雖不能編碼蛋白質(zhì)，但能夠通過(guò)吸附microRNAs(miRNAs)間接調(diào)控靶基因表達(dá)，以及對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行修飾[5,6]。HOX反義基因間RNA髓系1(HOX transcript antisense intergenic RNA, HOTAIRM1)是一種lncRNA，參與多種腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，包括結(jié)直腸癌、乳腺癌、急性髓細(xì)胞白血病[7,8]。然而，目前HOTAIRM1在CML中的作用仍有待闡明。miRNAs是一類長(zhǎng)約20～25個(gè)核苷酸的內(nèi)源性非編碼RNA，參與人類近1/3的基因表達(dá)，并且與腫瘤的生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。miRNAs主要通過(guò)多條信號(hào)通路來(lái)影響癌細(xì)胞的功能，其中包括WNT/β-catenin信號(hào)通路[9]。現(xiàn)有研究證實(shí)，miR-17-5p是HOTAIRM1的靶標(biāo)miRNA，并且調(diào)節(jié)癌細(xì)胞的生物學(xué)功能[10]。基于上述研究背景，本研究旨在揭示CML患者血清中l(wèi)ncRNA HOTAIRM1的表達(dá)水平，及其在CML發(fā)生發(fā)展中的作用及可能機(jī)制，從而探討HOTAIRM1作為CML的早期診斷標(biāo)志物及治療靶點(diǎn)的潛力。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株及主要試劑

CML細(xì)胞系(K562細(xì)胞)購(gòu)自美國(guó)ATCC公司。Lipofectamine 2000、cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司。IMDM培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)GIBCO公司。MTT溶液、RIPA裂解液、BCA蛋白濃度分析試劑盒、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、BeyoECL Plus(超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒)、Trizol試劑均購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所。聚偏氟乙烯(PVDF)膜購(gòu)自美國(guó)Millipore公司。DMSO購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司。Transwell購(gòu)自美國(guó)Corning公司。SYBR Green Master Mix購(gòu)自美國(guó)ABI公司。WNT5A一抗、β-catenin一抗、GAPDH一抗、HRP標(biāo)記的二抗均購(gòu)自英國(guó)Abcam公司。Dual-LuciferaseTMReporter Assay System E1910購(gòu)自美國(guó)Promega公司。

1.2 臨床CML樣本收集

采集陜西省人民醫(yī)院血液內(nèi)科2020年1月至2021年12月確診CML患者60例和健康體檢者60例受試者的血液樣本。所有患者術(shù)前均未行化療等治療，并排除合并有其他惡性腫瘤、全身嚴(yán)重感染等嚴(yán)重全身性疾病。整理病人臨床病理資料：包括年齡、性別等，并對(duì)病人進(jìn)行隨訪，記錄病人治療及預(yù)后情況。本研究已通過(guò)陜西省人民醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，本研究的所有患者均簽署試驗(yàn)知情同意書。

1.3 CML細(xì)胞的培養(yǎng)

采用含10%胎牛血清(FBS)的IMDM培養(yǎng)基培養(yǎng)CML細(xì)胞系(K562細(xì)胞)，培養(yǎng)條件為37 ℃、5%CO2。

1.4 CML細(xì)胞的分組和轉(zhuǎn)染處理

按照研究方案將K562細(xì)胞分為3類：①為了考察HOTAIRM1對(duì)K562細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲的影響，將K562細(xì)胞分為對(duì)照組、siRNA-NC組、siRNA-HOTAIRM1組、pcDNA-NC組和pcDNA-HOTAIRM1組；②為了考察miR-17-5p對(duì)K562細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲的影響，將K562細(xì)胞分為對(duì)照組、NC-mimic組、miR-17-5p-mimic組、NC-inhibitor組和miR-17-5p-inhibitor組；③為了考察HOTAIRM1是否通過(guò)miR-17-5p調(diào)控K562細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲，將K562細(xì)胞分為siRNA-HOTAIRM1+NC-inhibitor組和siRNA-HOTAIRM1+miR-17-5p-inhibitor組。委托吉瑪基因設(shè)計(jì)并合成siRNA-NC、siRNA-HOTAIRM1、pcDNA-NC、pcDNA-HOTAIRM1過(guò)表達(dá)質(zhì)粒、NC-mimic、miR-17-5p-mimic、NC-inhibitor和miR-17-5p-inhibitor。將K562細(xì)胞接種于6孔板，當(dāng)細(xì)胞達(dá)到80%融合時(shí)，利用Lipofectamine 2000按照分組要求分別對(duì)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染。未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞作為對(duì)照組。通過(guò)qRT-PCR方法檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率。不同分組的細(xì)胞轉(zhuǎn)染后均進(jìn)行MTT實(shí)驗(yàn)、Annexin Ⅴ/PI雙染色實(shí)驗(yàn)、Transwell實(shí)驗(yàn)、qRT-PCR和Western blot檢測(cè)。

1.5 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖

將K562細(xì)胞以每孔3 000個(gè)細(xì)胞的密度接種于96孔板，轉(zhuǎn)染后48 h，每孔分別加入MTT溶液和DMSO，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)在37 ℃、CO2下孵育4 h，用酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm的光密度值(OD)。

1.6 Transwell檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲

細(xì)胞轉(zhuǎn)染后，用無(wú)血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，按2×105/ml濃度接種于Transwell小室上部，下部加入含10%血清的培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h，用棉簽擦去上室底部未遷移的細(xì)胞，遷移到下室的細(xì)胞用結(jié)晶紫染色，顯微鏡下取6個(gè)隨機(jī)視野計(jì)數(shù)。此外，上室底部預(yù)先涂覆基質(zhì)膠，其他實(shí)驗(yàn)步驟同遷移，用于分析細(xì)胞侵襲能力。

1.7 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)

重組質(zhì)粒均由吉瑪基因合成。根據(jù)結(jié)合靶點(diǎn)設(shè)計(jì)miR-17-5p的3′-UTR結(jié)合序列及突變序列克隆到載體pGL3-promoter上，構(gòu)建pGL3-miR-17-5p-3′UTR野生(miR-17-5p-WT)和pGL3-miR-17-5p-3′UTR突變(miR-17-5p-MUT)重組質(zhì)粒。利用Lipofectamine 2000將miR-17-5p-WT或miR-17-5p-MUT及pcDNA-NC或pcDNA-HOTAIRM1共同轉(zhuǎn)染到K562細(xì)胞中。此外，構(gòu)建pGL3-WNT5A-3′UTR野生(WNT5A-WT)和pGL3-WNT5A-3′UTR突變(WNT5A-MUT)重組質(zhì)粒。利用Lipofectamine 2000將WNT5A-WT或WNT5A-MUT及NC-mimic或miR-17-5p-mimic共同轉(zhuǎn)染到K562細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染后48 h通過(guò)Dual-Luciferase?Reporter Assay System E1910檢測(cè)熒光強(qiáng)度，以Renilla熒光素酶為內(nèi)參。

1.8 qRT-PCR檢測(cè)受試者血清及細(xì)胞中HOTAIRM1、miR-17-5p、WNT5A和β-catenin的mRNA水平

收集60例CML患者和60例健康體檢者的清晨空腹靜脈血5 ml，3 000 r/min離心10 min分離血清。采用qRT-PCR方法分別檢測(cè)受試者血清及K562細(xì)胞中HOTAIRM1、miR-17-5p、WNT5A mRNA和β-catenin的mRNA水平。根據(jù)試劑盒說(shuō)明書，使用Trizol試劑從受試者血清及K562細(xì)胞中提取總RNA。使用NanoDrop分光光度計(jì)對(duì)RNA進(jìn)行定量。使用cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。基因特異性引物由生工生物工程(上海)股份有限公司提供(見(jiàn)表1)。使用SYBR Green Master Mix在ABI 7900HT熒光定量PCR儀上進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增條件如下：95 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃變性15 s，65 ℃退火延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)。GAPDH和U6為內(nèi)參基因。通過(guò)2-ΔΔCt法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.9 Western blot檢測(cè)細(xì)胞WNT5A和β-catenin的蛋白水平

用RIPA裂解液裂解K562細(xì)胞。用BCA蛋白濃度分析試劑盒測(cè)量蛋白濃度。用SDS-PAGE將40 μg的蛋白裂解產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。用5%的脫脂牛奶封閉PVDF膜2 h，然后在4 ℃下與1 ∶1 000稀釋的抗WNT5A和β-catenin、GAPDH的一抗孵育過(guò)夜，然后用1 ∶1 000稀釋的HRP標(biāo)記的二抗在室溫下孵育1 h。最后，使用ECL進(jìn)行顯影。GAPDH作為內(nèi)參蛋白。

1.10 統(tǒng)計(jì)分析

使用SPSS21.0軟件和GraphPad Prism 8.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量數(shù)據(jù)經(jīng)正態(tài)分布檢驗(yàn)后，通過(guò)t檢驗(yàn)比較兩組間差異，通過(guò)單因素方差分析及LSD事后檢驗(yàn)比較多組間差異。ROC曲線分析受試者血清HOTAIRM1和miR-17-5p診斷CML的價(jià)值。顯著性水平為P<0.05。

2 結(jié)果

2.1 CML患者和健康體檢者的血清HOTAIRM1和miR-17-5p表達(dá)水平

與健康體檢者相比，CML患者的血清中HOTAIRM1水平顯著升高(t=12.253，P<0.001)，血清中miR-17-5p水平顯著降低(t=15.601，P<0.001，見(jiàn)圖1)。ROC曲線分析結(jié)果顯示，血清中HOTAIRM1、miR-17-5p及兩者聯(lián)合診斷的曲線下面積(AUC)依次為0.945，0.958和0.998，診斷價(jià)值較高(見(jiàn)表2和圖 2)。不同性別和年齡的CML患者的血清HOTAIRM1和miR-17-5p水平均無(wú)顯著差異(P>0.05，見(jiàn)表3)。

與健康體檢者相比，***P<0.001圖1 CML患者和健康體檢者的血清中HOTAIRM1和miR-17-5p表達(dá)水平Figure 1 Serum HOTAIRM1 and miR-17-5p expression levels in CML patients and healthy subjects

A.血清HOTAIRM1診斷價(jià)值 B.血清miR-17-5p診斷價(jià)值 C.血清HOTAIRM1和miR-17-5p聯(lián)合診斷價(jià)值圖2 血清中HOTAIRM1和miR-17-5p診斷CML的ROC曲線Figure 2 ROC curves of serum HOTAIRM1 and miR-17-5p in the diagnosis of CML

表2 血清中HOTAIRM1和miR-17-5p診斷CML的價(jià)值分析Table 2 Clinical values of serum HOTAIRM1 and miR-17-5p in the diagnosis of CML

表3 不同性別和年齡的CML患者血清中HOTAIRM1和miR-17-5p水平Table 3 Serum HOTAIRM1 and miR-17-5p levels in CML patients of different genders and ages

2.2 HOTAIRM1對(duì)K562細(xì)胞增殖的影響

轉(zhuǎn)染后，與對(duì)照組或siRNA-NC組相比，siRNA-HOTAIRM1組HOTAIRM1相對(duì)表達(dá)量顯著降低(P<0.05)；與對(duì)照組或pcDNA-NC組相比，pcDNA-HOTAIRM1組HOTAIRM1相對(duì)表達(dá)量顯著升高(P<0.05，見(jiàn)圖3)。MTT檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組或siRNA-NC組相比，siRNA-HOTAIRM1組細(xì)胞活力顯著降低(P<0.05)；與對(duì)照組或pcDNA-NC組相比，pcDNA-HOTAIRM1組細(xì)胞活力顯著升高(P<0.05，見(jiàn)圖3)。

與對(duì)照組比較，*P<0.05；與siRNA-NC組比較，#P<0.05；與pcDNA-NC組比較，&P<0.05圖3 HOTAIRM1對(duì)K562細(xì)胞增殖的影響Figure 3 Effect of HOTAIRM1 on the proliferation of K562 cells

2.3 HOTAIRM1對(duì)K562細(xì)胞遷移和侵襲的影響

Transwell檢測(cè)顯示，與對(duì)照組或siRNA-NC組相比，siRNA-HOTAIRM1組細(xì)胞遷移和侵襲數(shù)量顯著降低(P<0.05)；與對(duì)照組或pcDNA-NC組相比，pcDNA-HOTAIRM1組細(xì)胞遷移和侵襲數(shù)量顯著升高(P<0.05，見(jiàn)圖4)。

與對(duì)照組比較，*P<0.05；與siRNA-NC組比較，#P<0.05；與pcDNA-NC組比較，&P<0.05圖4 HOTAIRM1對(duì)K562細(xì)胞遷移和侵襲的影響 (×400)Figure 4 The effect of HOTAIRM1 on the migration and invasion of K562 cells (×400)

2.4 HOTAIRM1對(duì)K562細(xì)胞WNT5A/β-catenin信號(hào)通路的影響

qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組或siRNA-NC組相比，siRNA-HOTAIRM1組WNT5A和β-catenin的mRNA相對(duì)表達(dá)量均顯著降低(P<0.05)；與對(duì)照組或pcDNA-NC組相比，pcDNA-HOTAIRM1組WNT5A和β-catenin的mRNA相對(duì)表達(dá)量均顯著升高(P<0.05，見(jiàn)圖5)。Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組或siRNA-NC組相比，siRNA-HOTAIRM1組的WNT5A和β-catenin蛋白相對(duì)表達(dá)量均顯著降低(P<0.05)；與對(duì)照組或pcDNA-NC組相比，pcDNA-HOTAIRM1組的WNT5A和β-catenin蛋白相對(duì)表達(dá)量均顯著升高(P<0.05，見(jiàn)圖5)。

與對(duì)照組比較，*P<0.05；與siRNA-NC組比較，#P<0.05；與pcDNA-NC組比較，&P<0.05圖5 HOTAIRM1對(duì)K562細(xì)胞中WNT5A和β-catenin表達(dá)的影響Figure 5 Effects of HOTAIRM1 on the expression of WNT5A and β-catenin in K562 cells

2.5 HOTAIRM1與miR-17-5p的靶向調(diào)控關(guān)系

Starbase數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)HOTAIRM1和miR-17-5p之間存在潛在結(jié)合位點(diǎn)(見(jiàn)圖6)，雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測(cè)結(jié)果顯示，與miR-17-5p-WT+pcDNA-NC組相比，miR-17-5p-WT+pcDNA-HOTAIRM1組的相對(duì)熒光素酶活性顯著降低(P<0.05，見(jiàn)圖6)。qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組或siRNA-NC組相比，siRNA-HOTAIRM1組的miR-17-5p相對(duì)表達(dá)量顯著升高(P<0.05)；與對(duì)照組或pcDNA-NC組相比，pcDNA-HOTAIRM1組顯著降低(P<0.05，見(jiàn)圖6)。

與miR-17-5p-WT+pcDNA-NC組比較，△P<0.05；與對(duì)照組比較，*P<0.05;與siRNA-NC組比較，#P<0.05；與pcDNA-NC組比較，&P<0.05圖6 HOTAIRM1與miR-17-5p的靶向調(diào)控關(guān)系Figure 6 Targeted regulation relationship between HOTAIRM1 and miR-17-5p

2.6 miR-17-5p與WNT5A的靶向調(diào)控關(guān)系

Starbase數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)miR-17-5p和WNT5A之間均存在潛在結(jié)合位點(diǎn)，與WNT5A-WT+NC-mimic組相比，WNT5A-WT+miR-17-5p-mimic組的相對(duì)熒光素酶活性顯著降低(P<0.05，見(jiàn)圖7)。

與WNT5A-WT+NC-mimic組比較，*P<0.05圖7 Starbase數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)HOTAIRM1與WNT5A的靶向調(diào)控關(guān)系及驗(yàn)證Figure 7 The targeting regulation relationship between HOTAIRM1 and WNT5A by Starbase database

2.7 miR-17-5p對(duì)K562細(xì)胞中WNT5A/β-catenin信號(hào)通路的調(diào)控作用

qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組或NC-mimic組相比，miR-17-5p-mimic組miR-17-5p相對(duì)表達(dá)量顯著升高，WNT5A和β-catenin的mRNA相對(duì)表達(dá)量均顯著降低(P<0.05)；與對(duì)照組或NC-inhibitor組相比，miR-17-5p-inhibitor組miR-17-5p相對(duì)表達(dá)量顯著降低，WNT5A和β-catenin的mRNA相對(duì)表達(dá)量均顯著升高(P<0.05，見(jiàn)圖8)。Western blot檢測(cè)顯示，與對(duì)照組或NC-mimic組相比，miR-17-5p-mimic組WNT5A和β-catenin蛋白相對(duì)表達(dá)量均顯著降低(P<0.05)；與對(duì)照組或NC-inhibitor組相比，miR-17-5p-inhibitor組的WNT5A和β-catenin蛋白相對(duì)表達(dá)量均顯著升高(P<0.05，見(jiàn)圖8)。

與對(duì)照組比較，*P<0.05；與NC-mimic組比較，#P<0.05；與NC-inhibitor組比較，&P<0.05圖8 miR-17-5p對(duì)K562細(xì)胞中WNT5A和β-catenin表達(dá)的影響Figure 8 Effects of miR-17-5p on the expression of WNT5A and β-catenin in K562 cells

2.8 miR-17-5p對(duì)K562細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的調(diào)控作用

與對(duì)照組或NC-mimic組相比，miR-17-5p-mimic組相對(duì)細(xì)胞活力顯著降低(P<0.05)；與對(duì)照組或NC-inhibitor組相比，miR-17-5p-inhibitor組相對(duì)細(xì)胞活力顯著升高(P<0.05，見(jiàn)圖9)。與對(duì)照組或NC-mimic組相比，miR-17-5p-mimic組遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)量均顯著降低(P<0.05)；與對(duì)照組或NC-inhibitor組相比，miR-17-5p-inhibitor組遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)量均顯著升高(P<0.05，見(jiàn)圖10)。

與對(duì)照組比較，*P<0.05；與NC-mimic組比較，#P<0.05；與NC-inhibitor組比較，&P<0.05圖9 miR-17-5p對(duì)K562細(xì)胞增殖的影響Figure 9 The effect of miR-17-5p on the proliferation of K562 cells

與對(duì)照組比較，*P<0.05；與NC-mimic組比較，#P<0.05；與NC-inhibitor組比較，&P<0.05圖10 miR-17-5p對(duì)K562細(xì)胞遷移和侵襲的影響 (×400)Figure 10 Effects of miR-17-5p on migration and invasion of K562 cells (×400)

2.9 HOTAIRM1通過(guò)miR-17-5p調(diào)控K562細(xì)胞增殖、遷移和侵襲及WNT5A/β-catenin信號(hào)通路

與si-HOTAIRM1+NC-inhibitor組相比，si-HOTAIRM1+miR-17-5p-inhibitor組相對(duì)細(xì)胞活力顯著升高(t=15.463，P<0.001)，遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)量均顯著升高(t=13.401，P<0.001；t=12.115，P<0.001，見(jiàn)圖11)。與si-HOTAIRM1+NC-inhibitor組相比，si-HOTAIRM1+miR-17-5p-inhibitor組WNT5A和β-catenin的mRNA(t=18.906，P<0.001；t=16.726，P<0.001)和蛋白(t=13.122，P<0.001；t=12.680，P<0.001)相對(duì)表達(dá)量均顯著升高(見(jiàn)圖12)。

與si-HOTAIRM1+NC-inhibitor組比較，*P<0.05圖11 HOTAIRM1通過(guò)miR-17-5p調(diào)控K562細(xì)胞增殖、遷移和侵襲 (×400)Figure 11 HOTAIRM1 regulates K562 cell proliferation, migration and invasion through miR-17-5p (×400)

與si-HOTAIRM1+NC-inhibtor組比較，*P<0.05圖12 HOTAIRM1通過(guò)miR-17-5p調(diào)控K562細(xì)胞WNT5A/β-catenin信號(hào)通路Figure 12 HOTAIRM1 regulates the WNT5A/β-catenin signaling pathway in K562 cells through miR-17-5p

3 討論

HOTAIRM1是一種位于HOXA1和HOXA2之間的lncRNA，參與各種腫瘤的發(fā)生發(fā)展，包括胰腺導(dǎo)管腺癌、乳腺癌和急性髓性白血病(acute myelogenous leukemia，AML)等。據(jù)報(bào)道，與癌旁組織相比，HOTAIRM1在胰腺導(dǎo)管腺癌組織中高表達(dá)[11]。HOTAIRM1在他莫昔芬耐藥乳腺癌MCF7細(xì)胞中上調(diào)，其通過(guò)介導(dǎo)雌激素受體+乳腺癌細(xì)胞中HOXA1的表達(dá)來(lái)促進(jìn)他莫昔芬耐藥[12]。HOTAIRM1的表達(dá)水平與AML患者的預(yù)后有關(guān)，HOTAIRM1的高表達(dá)與AML患者較短的總生存期、較短的無(wú)病生存期和較高的累積復(fù)發(fā)率顯著相關(guān)[13]。CML患者的血清HOTAIRM1表達(dá)上調(diào)，且對(duì)于CML的診斷具有較高價(jià)值。進(jìn)一步的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，HOTAIRM1的異常高表達(dá)誘導(dǎo)了K562細(xì)胞的增殖，增強(qiáng)了細(xì)胞的遷移和侵襲能力，沉默HOTAIRM1可抑制細(xì)胞增殖，降低細(xì)胞的遷移和侵襲能力。這些結(jié)果說(shuō)明HOTAIRM1在CML中是一種致癌lncRNA，沉默HOTAIRM1可抑制CML的發(fā)生發(fā)展。

miR-17-5p是miR-17-92基因簇成員之一，在不同癌癥中發(fā)揮致癌或抗癌作用。據(jù)報(bào)道，循環(huán)外泌體miR-17-5p可能是原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌的潛在預(yù)后生物標(biāo)志物[13]。miR-17-5p的高表達(dá)與淋巴管浸潤(rùn)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、較高的臨床分期、化學(xué)耐藥有關(guān)[14]。miR-17-5p的過(guò)表達(dá)促進(jìn)了人結(jié)腸癌細(xì)胞的侵襲性[15]。有研究表明，miR-17-5p在人乳腺腫瘤中低水平表達(dá)，可能作為抑癌基因起作用，miR-17-5p能通過(guò)抑制AIB1的翻譯降低雌激素受體調(diào)節(jié)基因表達(dá)，抑制乳腺癌細(xì)胞增殖[16]。miR-17-5p可阻止乳腺癌細(xì)胞進(jìn)入S期，從而抑制癌細(xì)胞的生長(zhǎng)[17]。本研究顯示，miR-17-5p在CML發(fā)病過(guò)程中異常降低，并且在診斷CML中具有較高價(jià)值。此外，miR-17-5p的低表達(dá)導(dǎo)致K562細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力增強(qiáng)，上述結(jié)果提示miR-17-5p可能在CML中充當(dāng)抗癌miRNA。lncRNA主要通過(guò)與靶miRNA結(jié)合來(lái)發(fā)揮生物學(xué)作用，本課題組通過(guò)生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)miR-17-5p與HOTAIRM1存在結(jié)合位點(diǎn)，其他文獻(xiàn)報(bào)道，miR-17-5p與HOTAIRM1內(nèi)源性競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合并調(diào)節(jié)胃癌細(xì)胞的進(jìn)程，包括細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和凋亡[10]。本研究考察了HOTAIRM1與miR-17-5p之間的關(guān)系。結(jié)果表明，HOTAIRM1靶向抑制miR-17-5p，HOTAIRM1可充當(dāng)抑制miR-106a-5p表達(dá)的分子海綿。此外，同時(shí)沉默K562細(xì)胞中HOTAIRM1和miR-17-5p可逆轉(zhuǎn)沉默HOTAIRM1對(duì)K562細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響，說(shuō)明HOTAIRM1通過(guò)miR-17-5p調(diào)控K562細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。

WNT/β-catenin信號(hào)通路的異常激活在腫瘤細(xì)胞的增殖、生長(zhǎng)、細(xì)胞凋亡、耐藥性等方面起著重要作用。據(jù)報(bào)道，靶向WNT/β-catenin信號(hào)通路的治療方式可有效抑制癌細(xì)胞增殖及侵襲能力[18]。WNT5A/β-catenin信號(hào)通路在CML發(fā)生發(fā)展中具有重要作用。隨著CML患者疾病的進(jìn)展，β-catenin的表達(dá)明顯升高，并且與伊馬替尼療效有關(guān)[19]。抑制WNT5A/β-catenin信號(hào)通路可抑制CML細(xì)胞增殖并促進(jìn)細(xì)胞凋亡[20]。因此，以WNT/β-catenin信號(hào)傳導(dǎo)通路為靶點(diǎn)，抑制CML中該通路的活化及其靶基因的表達(dá)有可能成為對(duì)CML治療的新方向。本研究表明，miR-17-5p靶向調(diào)控WNT5A，而HOTAIRM1靶向抑制miR-17-5p，并且HOTAIRM1的異常高表達(dá)激活了K562細(xì)胞中的WNT5A/β-catenin信號(hào)通路。Zhou等[21]也報(bào)道了miR-17-5p對(duì)WNT/β-catenin信號(hào)通路的調(diào)控作用。本研究結(jié)果說(shuō)明HOTAIRM1通過(guò)miR-17-5p調(diào)控K562細(xì)胞中WNT5A/β-catenin信號(hào)通路，沉默HOTAIRM1可能通過(guò)抑制WNT5A/β-catenin信號(hào)通路的激活從而發(fā)揮抗腫瘤作用。

綜上所述，本研究結(jié)果表明CML患者血清HOTAIRM1水平異常升高，沉默HOTAIRM1可有效降低CML細(xì)胞系的增殖、遷移和侵襲能力。HOTAIRM1可能通過(guò)miR-17-5p/WNT5A/β-catenin信號(hào)通路來(lái)調(diào)節(jié)CML的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。HOTAIRM1有望成為CML的新型早期診斷標(biāo)志物和新型治療靶點(diǎn)，具有重要的臨床價(jià)值和意義。