細絲蛋白C對前列腺癌細胞遷移和侵襲的影響

孫振業，宋 斌，王 磊，宋 多，高閆堯，楊 帆(空軍軍醫大學第二附屬醫院泌尿外科，西安 710032；通訊作者,E-mail:yangfan4220@163.com)

前列腺癌(prostatic cancer)是男性人群中一種常見的惡性腫瘤[1]，發生前列腺癌遠處轉移患者的5年生存率較低[2]。因此，前列腺癌的早期診斷和治療對患者預后有直接影響。前列腺癌的惡性進展與各種遺傳和表觀遺傳改變有關[3]。因此，識別調節前列腺癌進展的新基因可能有助于開發有效的前列腺癌治療基因靶點。細絲蛋白C(filamin C，FLNC)是一種細絲蛋白家族的成員，可促進癌細胞的遷移和侵襲[4]。一些研究表明，FLNC蛋白在肝細胞癌肝組織中高表達，可能是控制肝細胞癌侵襲和轉移的調控基因[5]。目前，定量蛋白質組學研究顯示FLNC在前列腺癌細胞中上調，而敲除FLNC可抑制細胞遷移[6]。然而，目前尚無文獻報道FLNC表達水平與前列腺癌患者預后的關系，及其調控癌細胞遷移和侵襲的可能機制。因此，本研究旨在探討FLNC在前列腺癌患者前列腺癌組織及配對癌旁組織中的表達及其與患者臨床特征和生存時間的關系，并探索其對癌細胞遷移和侵襲的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞和試劑 人前列腺癌細胞系(PC-3)購自美國ATCC公司。裂解緩沖液購自德國Roche公司。雙抗、胎牛血清、RPMI-1640培養基購自美國HyClone公司。Lipofectamine 3000試劑、TRIzol試劑購自美國Invitrogen公司。PrimeScriptTMRT試劑盒購自日本Takara公司。FastFire qPCR PreMix(SYBR Green)購自天根生化科技(北京)有限公司。3,3-二氨基聯苯胺(DAB)、結晶紫、MTT、RIPA緩沖液購自美國Sigma-Aldrich公司。Transwell、Matrigel購自美國Corning公司。BCA試劑盒、ECL試劑盒購自碧云天生物技術研究所。SDS-PAGE購自北京索萊寶科技有限公司。PVDF膜購自美國Millipore公司。一抗及二抗均購自英國Abcam公司。

1.1.2 研究對象 原發性前列腺癌組織及配對癌旁組織取自空軍軍醫大學第二附屬醫院2019年1月至2021年10月期間收治的30例前列腺癌患者，所有組織均液氮保存?；颊呔鶠槭状卧\斷，術前均未進行相關治療。本研究經空軍軍醫大學第二附屬醫院醫學倫理委員會批準通過(批號：No.2019-1-21-SW0016)，所有參與患者均知曉并簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 免疫組化染色檢測癌組織及癌旁組織中FLNC的表達 將石蠟包埋的組織切成5 μm厚的切片。組織切片用二甲苯脫蠟、梯度濃度乙醇復水、蒸餾水沖洗。然后將切片用3% H2O2浸泡10 min，0.01 mol/L檸檬酸鹽緩沖溶液中煮沸3 min，冷卻至室溫。用5%牛血清白蛋白室溫封閉1 h后，將切片與FLNC一抗(1 ∶500)在4 ℃孵育過夜，然后與辣根過氧化物酶標記的兔抗山羊IgG二抗(1 ∶500)室溫孵育1 h。用DAB顯色3～5 min，并用蘇木精復染。放大倍數為400倍的光學顯微鏡下觀察FLNC的染色情況。由兩名病理學家獨立選擇每張切片中的5個隨機視野，根據陽性染色細胞的百分比和染色強度，采用半定量評分系統對染色結果進行評估。強度評分0～3分(0分=陰性；1分：弱；2分：中度；3分：強)。染色強度1～4分(1分：0%～25%；2分：26%～50%；3分：51%～75%；4分：76%～100%)。陽性染色細胞的百分比和染色強度相乘計算最終染色評分。將所有患者分為FLNC低表達組(0～3分)和FLNC高表達組(4～12分)[7]。

1.2.2 細胞培養及shRNA轉染 人前列腺癌細胞系(PC-3)是一種廣泛用于前列腺癌基礎研究的細胞系，本研究在預實驗中檢測顯示，FLNC mRNA在PC-3細胞中的水平比人正常前列腺上皮細胞系(RWPE-1)升高了6.23倍，因此選用PC-3細胞進行本研究。將PC-3細胞在RPMI-1640培養基(含有10%胎牛血清和1%雙抗)中于37 ℃、5% CO2的培養箱中培養。抑制FLNC表達的小干擾RNA(siRNA-FLNC組)和陰性對照(siRNA-NC組)購自上海吉瑪制藥技術有限公司。將PC-3細胞分為對照組、siRNA-NC組和siRNA-FLNC組，使用Lipofectamine 3000試劑將siRNA-NC和siRNA-FLNC分別轉染到siRNA-NC組和siRNA-FLNC組細胞中，未轉染的細胞作為對照組。通過qRT-PCR和Western blot驗證轉染效率。

1.2.3 qRT-PCR檢測PC-3細胞中的FLNC mRNA表達水平 細胞轉染48 h后，使用TRIzol試劑提取細胞總RNA。使用PrimeScriptTMRT試劑盒將RNA(2 μg)樣品逆轉錄為cDNA。使用FastFire qPCR PreMix(SYBR Green)在美國Applied Biosystems STEP One Plus實時熒光定量PCR系統上進行PCR。RT-PCR引物：FLNC正向：5′-AGTGGCGTCAAGGTCTCAGG-3′，反向：5′-GCGGTGTACTGCACTCGGTA-3′；GAPDH正向：5′-GCTCTCTGCTCCTCCTGTTC-3′，反向：5′-ACGACCAAATCCGTTGACTC-3′。GAPDH為內參。PCR反應條件為95 ℃預變性30 s，95 ℃變性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，72 ℃延伸10 min。使用2-ΔΔCt法計算mRNA表達水平，結果表示為對照組的表達倍數。

1.2.4 MTT法檢測PC-3細胞活力 細胞轉染48 h后，將細胞以4×103個/孔的密度接種到96孔板中。培養48 h后，向孔中加入200 μl的0.5 mg/ml的MTT。37 ℃孵育4 h后，去掉細胞培養液，加入150 μl二甲基亞砜。使用BIO-TEK酶標儀檢測570 nm處的吸光度(OD值)。所有實驗一式六份，取平均值，結果表示為對照組的OD值倍數。

1.2.5 Transwell實驗檢測PC-3細胞侵襲和遷移能力 細胞轉染48 h后，采用Transwell實驗檢測PC-3細胞侵襲和遷移能力。

侵襲實驗中，將4×104個細胞(200 μl無血清培養基)添加到孔徑為8 μm的Transwell的上室中，上室預先用5%的Matrigel基質膠涂覆。下室加入800 μl含10%胎牛血清的培養基。37 ℃孵育48 h后，用濕棉簽輕輕刮擦未遷移的細胞。侵襲的細胞用4%多聚甲醛固定15 min，然后用結晶紫染色。倒置顯微鏡下隨機選取5個視野，計數侵襲的細胞數。

遷移實驗中，將4×104個細胞接種在未進行Matrigel基質膠涂覆的上室中，其余步驟與侵襲測定相同。

1.2.6 Western blot檢測PC-3細胞中FLNC、Eotaxin-1、CCR3、p-ERK1/2、t-ERK1/2和MMP-3的蛋白表達水平 細胞轉染48 h后，將細胞用冷PBS洗滌3次，在含有蛋白酶抑制劑的RIPA緩沖液(50 mmol/L Tris pH 8.0，150 mmol/L NaCl，0.1%SDS，1%NP-40，0.5%脫氧膽酸鈉)中裂解10 min。細胞裂解物以12 000 r/min離心15 min，然后收集上清液作為總蛋白。用BCA試劑盒測定蛋白質濃度。用10%～12%的SDS-PAGE凝膠分離蛋白質，并轉移到PVDF膜上，用5%的脫脂牛奶在室溫下封閉1 h，與FLNC(1 ∶2 000稀釋)、Eotaxin-1(1 ∶2 000稀釋)、CCR3(1 ∶2 000稀釋)、p-ERK1/2(1 ∶2 000稀釋)、t-ERK1/2(1 ∶2 000稀釋)、MMP-3(1 ∶2 000稀釋)和GAPDH(1 ∶2 000稀釋)一抗在4 ℃下孵育過夜，然后與辣根過氧化物酶標記的二抗(1 ∶2 000稀釋)在室溫下孵育1 h。通過ECL試劑盒進行顯影。GAPDH作為內部對照。

1.3 統計學分析

本研究采用SPSS 22.0軟件和GraphPad Prism v8.0軟件進行統計分析。計數數據采用卡方檢驗，計量數據采用配對t檢驗或單因素方差分析及Tukey事后檢驗。采用Kaplan-Meier法進行生存分析。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 FLNC蛋白在前列腺癌組織中高表達

免疫組化染色顯示，FLNC主要在細胞質中表達(見圖1)。與癌旁組織相比，前列腺癌組織中FLNC的染色評分升高(1.43±0.86vs5.63±2.91，t=7.143，P<0.001，見圖2)。

圖1 免疫組化染色檢測FLNC蛋白在前列腺癌組織和癌旁組織中的表達 (×400)Figure 1 Expression of FLNC protein in prostate cancer tissue and adjacent tissue by immunohistochemical staining (×400)

與癌旁組織比較，*P<0.05圖2 FLNC蛋白在前列腺癌組織和癌旁組織中染色評分Figure 2 Staining score of FLNC protein in prostate cancer tissue and adjacent tissue

2.2 FLNC低表達和高表達患者臨床資料和生存時間的比較

根據免疫組化染色評分將30例患者分為低表達組(n=9)和高表達組(n=21)。兩組患者的年齡和Gleason評分差異無統計學意義(P>0.05)。兩組患者的TNM分期和淋巴結轉移情況差異有統計學意義(P<0.05，見表1)。

表1 FLNC低表達和高表達患者的臨床參數Table 1 Clinical parameters of patients with low and high expression of FLNC

Kaplan-Meier生存分析顯示，FLNC低表達和高表達患者的生存時間差異有統計學意義，FLNC低表達患者的生存時間更長(χ2=4.372，P=0.037，見圖3)。

圖3 FLNC低表達和高表達患者的Kaplan-Meier生存分析Figure 3 Kaplan-Meier survival analysis of patients with low and high expression of FLNC

2.3 沉默FLNC可抑制前列腺癌細胞的生長

與對照組或siRNA-NC組相比，siRNA-FLNC組PC-3細胞中FLNC的mRNA和蛋白水平均降低(P<0.05)；各組間比較，PC-3細胞中FLNC的mRNA和蛋白表達水平差異均有統計學意義(mRNA：F=948.739，P<0.001；蛋白：F=558.216，P<0.001，見圖4)。MTT實驗結果顯示，與對照組或siRNA-NC組相比，siRNA-FLNC組相對細胞活力降低了56.76%(P<0.05)；各組間比較，PC-3細胞的活力差異有統計學意義(F=304.147，P<0.001，見圖5)。

與對照組比較，*P<0.05；與siRNA-NC組比較，#P<0.05圖4 轉染siRNA-FLNC下調了PC-3細胞中FLNC的表達Figure 4 Transfection of siRNA-FLNC downregulates the expression of FLNC in PC-3 cells

與對照組比較，*P<0.05；與siRNA-NC組比較，#P<0.05圖5 沉默FLNC對PC-3細胞活力的影響Figure 5 Effects of silencing FLNC on PC-3 cell viability

2.4 沉默FLNC可抑制前列腺癌細胞的遷移和侵襲

Transwell實驗結果顯示，與對照組或siRNA-NC組相比，siRNA-FLNC組的細胞遷移和侵襲數量均降低(P<0.05)；各組間比較，PC-3細胞的遷移和侵襲能力差異有統計學意義(遷移：F=168.572，P<0.001；侵襲：F=36.614，P<0.001，見圖6)。

與對照組比較，*P<0.05；與siRNA-NC組比較，#P<0.05圖6 Transwell實驗檢測沉默FLNC對PC-3細胞遷移和侵襲的影響 (×400)Figure 6 Effects of silencing FLNC on PC-3 cell migration and invasion by Transwell (×400)

2.5 沉默FLNC對前列腺癌細胞中Eotaxin-1/CCR3軸的影響

Western blot結果顯示，與對照組或siRNA-NC組相比，siRNA-FLNC組PC-3細胞中Eotaxin-1、CCR3、p-ERK1/2和MMP-3的蛋白相對表達量均降低(P<0.05)。各組間比較，PC-3細胞中Eotaxin-1、CCR3、p-ERK1/2和MMP-3的蛋白相對表達量差異有統計學意義(Eotaxin-1：F=780.288，P<0.001；CCR3：F=426.040，P<0.001；p-ERK1/2：F=1 031.749，P<0.001；MMP-3：F=490.832，P<0.001)，t-ERK1/2的蛋白相對表達量差異無統計學意義(F=1.327，P=0.295，見圖7)。

與對照組比較，*P<0.05；與siRNA-NC組比較，#P<0.05圖7 Western blot檢測沉默FLNC對PC-3細胞中Eotaxin-1/CCR3軸相關蛋白表達的影響Figure 7 Effects of silencing FLNC on the expression of Eotaxin-1/CCR3 axis-related proteins in PC-3 cells by Western blot

3 討論

細絲蛋白(filamin，FLN)是一組肌動蛋白結合蛋白，參與調節細胞內的肌動蛋白細胞骨架，并且調節腫瘤細胞的惡性行為[8,9]。FLNC屬于FLN家族，Qi等[5]通過iTRAQ方法鑒定了肝細胞癌患者肝組織中4 620個蛋白質，并對其中3 781個蛋白質進行了定量分析，發現FLNC在癌組織中過表達，且參與了癌細胞的遷移、侵襲、黏附等多種功能[5]。Tanabe等[4]研究表明，FLNC在食管鱗癌中高表達，且與淋巴侵襲、轉移和預后有關。Kamil等[10]報道，FLNC表達增高與多形性膠質母細胞瘤(glioblastoma multiforme，GBM)患者預后不良相關。Adachi-Hayama等[11]也報道FLNC在膠質瘤組織中的表達水平隨腫瘤分級的升高而升高。Ai等[6]通過定量蛋白質組學證實FLNC在高遷移潛能的前列腺癌細胞中高表達，下調FLNC可顯著抑制前列腺癌細胞遷移。與這些研究一致，本研究觀察到前列腺癌組織中FLNC的表達高于癌旁組織。此外，FLNC的高表達與TNM分期、淋巴結轉移和生存期顯著相關。

癌細胞的轉移與其遷移和侵襲能力直接相關。Kamil等[10]研究顯示，GBM細胞系中FLNC過表達與侵襲力增強呈正相關。Tanabe等[4]報道，FLNC基因敲除減少了食管鱗狀細胞癌細胞遷移和侵襲，其機制是通過激活Rho GTP酶以增加細胞的轉移能力而實現的。本研究推測FLNC可能參與了對前列腺癌細胞遷移和侵襲能力的調節。研究顯示，沉默FLNC抑制了PC-3細胞的生長、遷移和侵襲?；|金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMPs)家族是調控腫瘤侵襲和轉移的重要蛋白家族，MMPs通過降解各種細胞外基質參與癌細胞的侵襲過程[12]。MMP-3的高表達提高了多種癌細胞的遷移和侵襲能力[13,14]。本研究檢測了PC-3細胞中MMP-3的表達，研究顯示，沉默FLNC下調了PC-3細胞中MMP-3的表達。此外，ERK通路是調控癌癥惡性轉化的重要途徑[15]，并且，MMP-3的活性受到ERK通路的調節[16-18]。本研究中，沉默FLNC也抑制了PC-3細胞中ERK1/2的激活，這些結果提示FLNC對前列腺癌細胞遷移和侵襲的調控作用可能是由ERK1/2-MMP-3通路介導的。

趨化因子和受體網絡調節癌細胞的遷移和侵襲[19-22]。嗜酸性粒細胞趨化因子(Eotaxin)家族是一組歸巢相關的CC趨化因子[23-25]。據報道，Eotaxin-1是一種候選前列腺癌生物標記物[26]。Eotaxin-1主要通過其受體CC趨化因子受體-3(CC chemokine receptor 3，CCR3)發揮作用，并且Eotaxin-1和CCR3在人腎細胞癌、膠質母細胞瘤等癌細胞中表達上調[27-29]。Eotaxin-1和CCR3的高表達促進了間變性大細胞淋巴瘤細胞的生長和存活[30]。另外，Eotaxin-1通過激活CCR3還可促進脈絡膜血管內皮細胞的移行[31]。本研究顯示，沉默FLNC降低了PC-3細胞中Eotaxin-1和CCR3的表達。據報道，CCR3在淋巴瘤細胞中可激活ERK通路[30]，而Eotaxin-1通過激活ERK1/2上調人軟骨細胞中MMP-3的表達[32]。Eotaxin-1通過CCR3-ERK通路上調MMP-3的表達，并促進前列腺癌細胞的侵襲[33]。由以上研究背景推測，FLNC的高表達可能通過激活Eotaxin-1-CCR3-ERK1/2-MMP-3通路進而促進前列腺癌細胞的遷移和侵襲。

綜上所述，本研究表明FLNC在前列腺癌組織中高表達并且與患者預后相關。沉默FLNC可能通過抑制Eotaxin-1-CCR3-ERK1/2-MMP-3通路降低前列腺癌細胞的遷移和侵襲能力。