miR-21-5p通過調控自噬減輕肥厚性心肌病小鼠的心肌損傷

王 偉，李 煒，韓 楊，張艷濤，張 杰，張曉東，廉 誠(西安國際醫學中心醫院心臟內科，西安 710100；通訊作者,E-mail:Lchengafmu@126.com)

心力衰竭是因各種心臟疾病導致心功能下降，從而引起心臟循環障礙的一組癥候群，在世界范圍內有著較高的發病率和死亡率[1]。瓣膜疾病、壓力超負荷、心肌缺血和心肌細胞疾病均是其主要病因。其中，壓力超負荷相關的肥厚型心肌病(hypertrophic cardiomyopathy, HCM)是導致心力衰竭最常見的病因之一[2]。病理生理學上，HCM是由心肌細胞肥大以及成纖維細胞和細胞外基質的顯著增加引起的心肌質量的異常生長。這一過程最初是一種適應性反應，通過減少室壁應力和能量消耗來維持心臟功能[3]。然而，隨著心肌細胞肥大和負荷的增加，與維持血液供應的微血管的生長/增殖不相匹配，最終導致心臟代謝失衡，進而發展為失代償性心力衰竭[4]。

微小RNA(microRNAs, miRNAs)是一種小的非編碼RNA，通過RNA干擾途徑調節轉錄后的基因表達[5]。miR-21-5p在不同的人體組織中廣泛表達，其表達的變化已在包括心血管疾病在內的多種疾病中得到證實[6]。近年來，越來越多的證據表明，miR-21-5p對缺血/再灌注損傷后的心臟具有明顯的保護作用，并且在老年急性心肌梗死患者的血清中miR-21-5p表達水平也顯著改變[7,8]。然而，關于miR-21-5p對HCM發揮何種生物學效應目前尚無相關報道。因此，本研究旨在通過主動脈弓縮窄術建立肥厚性心肌病模型，觀察miR-21-5p對心肌肥厚小鼠的影響并探討其潛在的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及試劑

SPF級雄性C57BL/6小鼠40只，8周齡，體質量20～25 g，購于空軍軍醫大學動物實驗中心，動物合格證號：SCXK(軍)2007-007號。TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒及PI3K抑制劑LY294002購自美國Sigma-Aldrich公司。逆轉錄TaqMan miRNA試劑盒購自美國Thermo公司。miR-21-5p agomir購自上海吉瑪公司。膠原蛋白3(Collagen-3)、肌球蛋白樣BCL2結合蛋白1(Beclin1)、自噬受體蛋白(P62)、微管相關蛋白輕鏈3(LC3)、磷脂酰肌醇-3-羥激酶(PI3K)、蛋白激酶B(PKB/Akt)、雷帕霉素靶蛋白(mTOR)和重組人β-肌動蛋白(β-actin)抗體購自美國Abcam公司。

1.2 動物模型的建立及分組處理

肥厚性心肌病動物模型采用經典的主動脈弓縮窄術建立[9]，具體操作如下：小鼠吸入2%異氟醚麻醉后，置于有加熱裝置的操作平臺上，將術中核心體溫維持在37 ℃左右。使用小型動物呼吸機給予正壓通氣。經胸骨上部切開并打開胸壁后，仔細分離辨認出主動脈。在主動脈弓上放置25號穿刺針，并在左右頸總動脈之間用7-0絲線結扎，隨后小心取出穿刺針。手術結束后，逐層縫合胸壁。假手術組小鼠除不結扎主動脈外，其余操作均與模型組相同。

將40只C57BL/6小鼠隨機分為4組：假手術組(sham組)、模型組(TAC組)、miR-21-5p激動劑處理組(agomiR-21-5p組)和miR-21-5p激動劑+PI3K抑制劑處理組(agomiR-21-5p+LY294002組)，每組10只。agomiR-21-5p組和agomiR-21-5p+LY294002組小鼠在TAC術后每間隔3 d經尾靜脈注射10 nmol/L的miR-21-5p agomir，共計10次。agomiR-21-5p+LY294002組小鼠在給予miR-21-5p agomir注射的同時行腹腔注射LY294002(50 mg/kg)處理。所有小鼠均繼續飼養至60 d進行小動物超聲后處死并取材。

1.3 心功能測定

經胸超聲心動圖采用M型標準二維超聲心動圖檢查。在左胸骨旁長軸方位、左心室二尖瓣和乳頭肌水平測量左心室內部尺寸，即左室舒張末期內徑(left ventricular end-diastolic dimension，LVEDD)、左室收縮末期內徑(left ventricular end-systolic dimension，LVESD)，至少監測3個連續的心臟周期。使用軟件計算出左室射血分數(left ventricular ejection，LVEF)和左室短軸縮短率(left ventricular fractional shortening，LVFS)。

1.4 心肌組織學指標測定

處死前稱小鼠體質量，分離新鮮心臟及右下肢脛骨，用PBS沖洗血液，切除血管、肌肉等多余組織，獲取心臟質量及脛骨長度，計算心體比(heart weight/body weight, HW/BW)和心脛比(heart weight/tibial length, HW/TL)。

1.5 心肌組織切片染色

小鼠心臟組織取材后經4%多聚甲醛固定，石蠟包埋并切片，分別進行如下染色操作：①HE和Masson染色：按常規染色步驟進行染色并拍照，用Image J軟件分析各組心臟的心肌細胞橫截面積及纖維化程度。②TUNEL染色：組織切片經脫蠟、水合后，滴加蛋白酶K進行打孔處理。按TUNEL染色試劑盒說明書避光依次滴加TUNEL染液(著色凋亡細胞核)及DAPI染液(著色全部細胞核)。在每組切片中隨機選擇3個部位進行拍照并分析。凋亡計算公式為：TUNEL陽性細胞核(綠色)/細胞核總數(藍色)。③免疫組化和免疫熒光染色：先用3% H2O2處理復水石蠟切片30 min，然后在室溫下用Immuno-Block試劑孵育30 min。切片分別與Collagen-3(1 ∶500)和LC3B(1 ∶500)特異性的一抗孵育，使用無關抗體對對照組切片孵育。在每組切片中隨機選擇3個部位進行拍照并分析。用Image J軟件分析，以Collagen-3染色強度表示心肌組織膠原沉著程度，以LC3B熒光強度表示心肌組織自噬程度。

1.6 qRT-PCR法檢測心肌miR-21-5p及肥厚基因(ANP、α-MHC、β-MHC)表達

用Trizol試劑提取心臟組織總RNA，使用高容量cDNA逆轉錄試劑盒對總RNA進行反轉錄。qRT-PCR使用TaqMan miRNA檢測試劑盒進行。實時PCR系統運行反應條件設定為：94 ℃熱反應循環30 s，94 ℃ 5 s和60 ℃ 30 s，重復40次。miR-21-5p、U6、心房利鈉肽(atrial natriuretic peptide, ANP)、肌球蛋白重鏈α(myosin heavy chain-α, α-MHC)、肌球蛋白重鏈β(myosin heavy chain-β, β-MHC)和磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde phosphate dehydrogenase, GAPDH)引物由上海吉凱基因公司合成(見表1)，miR-21-5p的表達量以U6為參照，ANP、α-MHC和β-MHC的表達量以GAPDH為參照。

表1 相關基因序列Table 1 Related gene sequence

1.7 Western blot法檢測心肌組織蛋白(Beclin1、p62、LC3、PI3K、Akt、mTOR)表達

將等量(50 μg)的蛋白質提取物用丙烯酰胺梯度進行SDS-PAGE分離。電泳后，分離的蛋白質被轉移到聚偏二氟乙烯膜上。非特異性位點經5%脫脂牛奶孵育過夜阻斷。膜與Beclin1、P62、LC3、p-PI3K、p-Akt、p-mTOR、PI3K、Akt、mTOR和β-actin的一抗(1 ∶1 000)在4 ℃過夜孵育。用辣根過氧化物酶偶聯免疫球蛋白IgG抗體作為二抗(1 ∶5 000)，室溫孵育1 h。以β-actin作為內參照，采用Bio-Rad軟件對各蛋白條帶進行量化分析。以p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt和p-mTOR/mTOR比值表示心肌組織PI3K/Akt通路激活程度，以Beclin1、P62表達和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值表示心肌組織自噬強度。

1.8 統計學分析

2 結果

2.1 心肌miR-21-5p及PI3K/Akt信號通路表達比較

與sham組相比，TAC組小鼠心肌miR-21-5p相對表達水平顯著降低(P<0.01)，p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt和p-mTOR/mTOR比值均明顯下調(P<0.01)；與TAC組相比，agomiR-21-5p組小鼠心肌miR-21-5p表達顯著增加(P<0.01)，p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt和p-mTOR/mTOR比值均明顯上調(P<0.01)；與agomiR-21-5p組相比，agomiR-21-5p+LY294002組小鼠心肌miR-21-5p表達差異無統計學意義(P>0.05)，而p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt和p-mTOR/mTOR比值均明顯下調(P<0.01，見圖1)。

與sham組相比，##P<0.01；與TAC組相比，&&P<0.01；與agomiR-21-5p組相比，**P<0.01圖1 各組小鼠心肌miR-21-5p及PI3K、Akt、mTOR蛋白表達比較Figure 1 Comparison of the expression of miR-21-5p and PI3K, Akt and mTOR between groups

2.2 小鼠心臟功能比較

與sham組相比，TAC組小鼠的心臟超聲指標LVEF和LVFS值明顯降低(P<0.01)，LVESD和LVEDD值顯著升高(P<0.01)，提示心臟收縮功能明顯下降；與TAC組相比，agomiR-21-5p組小鼠心臟超聲指標LVEF和LVFS值明顯升高(P<0.01)，LVESD和LVEDD值顯著降低(P<0.01)，提示心臟收縮功能得到明顯改善；與agomiR-21-5p組相比，agomiR-21-5p+LY294002組小鼠心臟LVEF和LVFS值明顯下降(P<0.01)，LVESD和LVEDD值顯著增加(P<0.01，見圖2)，提示心臟收縮功能又明顯受損。

與sham組相比，#P<0.05，##P<0.01；與TAC組相比，&&P<0.01；與agomiR-21-5p組相比，**P<0.01圖2 各組小鼠心臟超聲檢測結果Figure 2 Comparison of myocardial ultrasonic parameters of mice between groups

2.3 心肌肥厚指標比較

與sham組相比，TAC組小鼠的HW/BW和HW/TL值顯著增加，心肌細胞橫截面積明顯增大(P<0.01)；與TAC組相比，agomiR-21-5p組小鼠HW/BW和HW/TL值顯著降低，心肌細胞橫截面積明顯減小(P<0.01)；與agomiR-21-5p組相比，agomiR-21-5p+LY294002組小鼠HW/BW和HW/TL值顯著升高，心肌細胞橫截面積明顯增加(P<0.01，見圖3)。

與sham組相比，#P<0.05，##P<0.01；與TAC組相比，&&P<0.01；與agomiR-21-5p組相比，**P<0.01圖3 各組小鼠心肌肥厚指標比較 (HE,×400)Figure 3 Comparison of histological indexes of cardiac hypertrophy between groups (HE,×400)

2.4 心肌肥厚相關基因表達比較

與sham組相比，TAC組小鼠心肌α-MHC mRNA表達明顯降低，β-MHC及ANP mRNA表達顯著增加(P<0.01)；與TAC組相比，agomiR-21-5p組小鼠心肌α-MHC mRNA表達明顯增加，β-MHC及ANP mRNA表達顯著降低(P<0.01)；與agomiR-21-5p組相比，agomiR-21-5p+LY294002組小鼠心肌α-MHC mRNA表達明顯下降，β-MHC及ANP mRNA表達顯著升高(P<0.01，見圖4)。

與sham組相比，##P<0.01；與TAC組相比，&&P<0.01；與agomiR-21-5p組相比，**P<0.01圖4 各組小鼠心肌肥厚相關基因表達比較Figure 4 Comparison of gene expression of cardiac hypertrophy-related markers between groups

2.5 心肌纖維化程度比較

與sham組相比，TAC組小鼠的心肌組織纖維化程度及Collagen-3膠原沉著顯著增加(P<0.01)；與TAC組相比，agomiR-21-5p組小鼠心肌組織纖維化程度及Collagen-3膠原沉著顯著降低(P<0.01)；與agomiR-21-5p組相比，agomiR-21-5p+LY294002組小鼠心肌組織纖維化程度及Collagen-3膠原沉著顯著增多(P<0.01，見圖5)。

與sham組相比，#P<0.05，##P<0.01；與TAC組相比，&&P<0.01；與agomiR-21-5p組相比，**P<0.01圖5 各組小鼠心肌纖維化程度比較Figure 5 Comparison of the degree of myocardial fibrosis between groups

2.6 心肌細胞凋亡水平比較

與sham組相比，TAC組小鼠的心肌細胞凋亡率顯著增加(P<0.01)；與TAC組相比，agomiR-21-5p組小鼠心肌細胞凋亡率顯著降低(P<0.01)；與agomiR-21-5p組相比，agomiR-21-5p+LY294002組小鼠心肌細胞凋亡率顯著升高(P<0.01，見圖6)。

2.7 心肌組織自噬蛋白LC3B免疫熒光表達比較

與sham組相比，TAC組小鼠心肌組織中自噬蛋白LC3B的熒光表達顯著增加(P<0.01)；與TAC組相比，agomiR-21-5p組小鼠心肌組織自噬蛋白LC3B的熒光表達顯著降低(P<0.01)；與agomiR-21-5p組相比，agomiR-21-5p+LY294002組小鼠心肌組織自噬蛋白LC3B的熒光表達顯著增強(P<0.01，見圖7)。

紅色熒光顯示LC3B染色，藍色熒光顯示細胞核染色；與sham組相比，##P<0.01；與TAC組相比，&&P<0.01；與agomiR-21-5p組相比，**P<0.01圖7 各組小鼠心肌自噬蛋白LC3B免疫熒光表達比較 (×400)Figure 7 Comparison of immunofluorescence expression of LC3B between groups (×400)

2.8 心肌組織自噬相關蛋白表達比較

與sham組相比，TAC組小鼠的心肌組織Beclin1蛋白表達和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比例顯著增加，P62蛋白表達明顯降低(P<0.01)；與TAC組相比，agomiR-21-5p組小鼠心肌組織Beclin1蛋白表達和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比例顯著減低，P62蛋白表達明顯增加(P<0.01)；與agomiR-21-5p組相比，agomiR-21-5p+LY294002組小鼠心肌組織Beclin1蛋白表達和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比例顯著上調，P62蛋白表達明顯下調(P<0.01，見圖8)。

與sham組相比，##P<0.01；與TAC組相比，&&P<0.01；與agomiR-21-5p組相比，**P<0.01圖8 各組小鼠心肌自噬相關蛋白表達比較Figure 8 Comparison of the expression of autophagy-related proteins between groups

3 討論

肥厚性心肌病的病理學特征已被公認為是心臟重塑，即心肌細胞和間質的改變，繼而影響心臟大小、形態和功能[2]。心臟重塑是不同心臟疾病的共同途徑，被認為是導致心臟功能障礙的重要方面，也是心衰臨床病程進展的確定因素[10]。據報道，左心室重構在多種心臟疾病中均廣泛存在，如肥厚性心肌病、擴張性心肌病、心肌梗死和慢性缺血性心臟病[11]。心臟重構不僅是預測心臟功能惡化的重要參數，也是心衰患者長期預后不良的重要臨床指標。肥厚心臟的心肌通常經歷許多結構改變，最顯著的是心肌細胞的肥大和細胞外基質的增加，通常被視為原發性纖維化[12]。研究進一步發現，間質纖維化和過度積累的細胞外基質在調節左心室重塑中起著至關重要的作用[13]。此外，肥厚性心肌病的心肌纖維化不僅被發現與心臟功能受損和心力衰竭有關，而且被認為是室性心律失常和猝死的關鍵因素[14]。

本研究中同樣觀察到，與sham組相比，經胸超聲心動圖測量的參數顯示了TAC組小鼠左室收縮功能顯著降低。且TAC組小鼠的HW/BW及HW/TL顯著增加，心肌組織ANP和β-MHC mRNA表達明顯上升。此外，與sham組相比，TAC組小鼠心肌細胞橫截面積明顯增大，并且TAC組小鼠心肌組織纖維化面積、Collagen-3膠原沉積比例和凋亡細胞均顯著增加。因此，我們的結果證實主動脈弓縮窄術可以成功地建立小鼠肥厚性心肌病模型。

近年來miRNAs在調節人類疾病(包括心肌肥厚和心力衰竭)中的作用受到了廣泛關注[15]。例如，抑制miRNA-146a可減輕壓力超負荷誘導的心肌肥厚和功能障礙[16]。抑制miR-206的表達加重了心肌缺血/再灌注損傷，而減輕了壓力超負荷誘導的心肌肥厚[17]。此外，Osmak等[18]最近發現hsa-miR-21-5p是調控人類心肌肥厚的重要miRNAs之一，并且Pizzino等[19]的研究表明，miR-21-5p抑制劑可以促進靜息心肌細胞的輕微增大，并進一步增強了血管Ⅱ介導的HL1心肌細胞肥厚反應。然而，miR-21-5p在主動脈弓縮窄術誘導的小鼠心肌肥厚中的確切作用仍有待進一步探索。我們的實驗結果發現，與sham組相比，TAC組小鼠心肌miR-21-5p的表達顯著下調。給予miR-21-5p agomir處理后，與TAC組相比，agomiR+21-5p組小鼠心肌miR-21-5p的表達顯著上調，且心肌組織超微結構病理改變及心肌細胞凋亡被顯著逆轉，進而肥厚性心肌病小鼠的心臟功能及心室重構均得到明顯改善。上述研究結果顯示，miR-21-5p過表達在延緩肥厚性心肌病心肌病理結構改變上具有顯著效果，進一步表明了miR-21-5p在減輕肥厚性心肌病心肌損傷方面的有效性。

自噬是一種進化上保守的分解代謝過程，用于降解和回收長壽命的蛋白質和受損的細胞器[20]。在生理條件下，低水平的自噬發揮細胞保護和細胞器更新的作用，該過程對維持心臟穩態具有至關重要的作用。相反，過度的自噬激活會加重病理性心臟重塑[21]。雖然自噬誘導的機制還不完全清楚，許多研究已經確定了自噬在肥厚性心肌病發展中的作用。在從肥厚性心肌病向心力衰竭過渡的患者的心內膜心肌活檢中，觀察到大量自噬空泡，這表明自噬在肥厚性心肌病心臟的晚期階段被顯著激活，進而加重了心肌損傷[22,23]。此外，miRNAs、自噬和心肌肥厚之間的交聯最近已被證實。miR-365通過靶向Skp2負向調節肥厚心肌細胞的自噬[24]。miR-34a通過抑制ATG9A表達和自噬活性，調控血管緊張素Ⅱ誘導的心肌肥厚[25]。然而，miR-21-5p對肥厚性心肌病心肌自噬的影響尚未明確。本實驗發現，與sham組相比，TAC組小鼠心肌自噬核心蛋白LC3B熒光表達明顯增強，且LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比例及自噬早期膜成核蛋白Beclin1的表達顯著增加，同時選擇性自噬多功能蛋白P62表達明顯上調，這些結果均與上述研究結果相一致。同樣的，給予miR-21-5p agomir處理后，肥厚性心肌病小鼠心肌組織自噬水平明顯減低，這表明miR-21-5p過表達對肥厚性心肌病心肌損傷的保護作用可能是通過抑制心肌過度自噬來實現的。

磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信號通路已被證實是調節細胞自噬的關鍵通路[26]。mTORC直接參與調節細胞自噬蛋白的活動，其上游調控因子主要為PI3K/Akt軸。PI3K催化亞基通過激活Akt蛋白進而激活mTORC以整合來自細胞環境的信號通路，最終抑制細胞自噬反應[27]。已有研究發現PI3K/Akt信號在心肌肥厚中對自噬的調控作用[28,29]，然而其是否介導了miR-21-5p對肥厚性心肌病心肌組織過度自噬的抑制仍需進一步探究。本研究首先觀察到，與sham組相比，TAC組小鼠心肌組織PI3K/Akt信號表達明顯被抑制，給予miR-21-5p agomir處理后，肥厚性心肌病小鼠心肌組織PI3K/Akt信號表達顯著上調，表明PI3K/Akt信號可能是miR-21-5p減輕肥厚性心肌病心肌損傷的關鍵通路。通過引入PI3K信號特異性抑制劑LY294002，我們進一步發現，PI3K/Akt信號被miR-21-5p激活時，肥厚性心肌病小鼠心肌組織自噬水平顯著降低，心肌損傷明顯減輕。而阻斷PI3K/Akt信號后，肥厚性心肌病小鼠心肌組織自噬水平又明顯增強，心肌損傷又進一步加重。

綜上所述，本研究首次觀察到miR-21-5p過表達可顯著緩解肥厚性心肌病小鼠的心肌損傷，能夠有效改善小鼠心臟功能惡化并延緩心肌細胞肥大和心肌組織纖維化進展，其作用可能與其激活PI3K/Akt信號通路，進而抑制心肌過度自噬有關。