紫草素對(duì)人牙周膜干細(xì)胞增殖和分化的影響

侯夏沛，劉 芬(西北婦女兒童醫(yī)院口腔科，西安 710061；通訊作者,E-mail:fenfen2alei@163.com)

隨著干細(xì)胞技術(shù)、分子生物學(xué)和組織工程的快速發(fā)展，牙周組織再生技術(shù)已經(jīng)成為牙周疾病治療中的熱點(diǎn)技術(shù)[1]。人牙周膜干細(xì)胞(human periodontal ligament stem cells, hPDLSCs)是再生工程技術(shù)的種子細(xì)胞之一[2]。其他研究者報(bào)道，將hPDLSCs移植到免疫低下的嚙齒動(dòng)物體內(nèi)時(shí)，hPDLSCs會(huì)逐漸形成牙本質(zhì)的骨樣和牙周結(jié)構(gòu)[3]。因此，hPDLSCs的成骨分化可能有助于牙周再生和修復(fù)。然而，當(dāng)hPDLSCs應(yīng)用于牙周組織再生時(shí)，其數(shù)量和功能有限[4]。因此，尋找促進(jìn)hPDLSCs增殖和成骨分化的藥物是牙周再生和修復(fù)成功與否的關(guān)鍵。紫草素(shikonin，SHI)是一種從紫草中提取的活性成分，分子式為C16H16O5，其抗炎特性已被廣泛報(bào)道[5-7]。據(jù)報(bào)道，紫草素通過(guò)下調(diào)白細(xì)胞介素-1(interleukin-1, IL-1)、IL-6和腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)的表達(dá)來(lái)防止中波紫外線誘導(dǎo)的角質(zhì)形成細(xì)胞炎癥[8]。紫草素可降低骨髓來(lái)源的樹突細(xì)胞中的IL-4、IL-5和TNF-α的表達(dá)[9]。紫草素可下調(diào)骨關(guān)節(jié)炎小鼠的關(guān)節(jié)中IL-1和TNF-α的表達(dá)[10]。炎性細(xì)胞因子在牙周炎中的重要性已被廣泛證實(shí)。在牙周炎的發(fā)展過(guò)程中，IL-1、IL-6和TNF-α的過(guò)度表達(dá)可破壞牙周支持組織[11]。有研究報(bào)道，紫草素可抑制脂多糖誘導(dǎo)的人牙周膜細(xì)胞中IL-1、IL-6和TNF-α的過(guò)度表達(dá)[12]，提示紫草素可能具有抗牙周炎的作用。基于上述研究背景，本課題組推測(cè)紫草素可能是一種牙周組織再生的輔助藥物。因此，本研究考察了紫草素對(duì)人hPDLSCs增殖和分化的影響，從而為牙周組織重建提供候選藥物。

1 材料與方法

1.1 材料

紫草素(HPLC≥98%)購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。二甲基亞砜(DMSO)、胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶、茜素紅染色液均購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司。STRO-1、CD-146、CD34、CD45、Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(RUNX2)、骨鈣素(OCN)、Smad4和β-actin一抗、山羊抗兔IgG H&L(HRP)二抗、FITC標(biāo)記的熒光二抗均購(gòu)自英國(guó)Abcam公司。MTT試劑盒購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。α-MEM培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)HyClone公司。堿性磷酸酶染色試劑盒、堿性磷酸酶活性測(cè)定試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所。RIPA細(xì)胞裂解液購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所。TRIzol總RNA提取緩沖液、Revertaid First Strand cDNA合成試劑盒、增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光(ECL)底物試劑盒均購(gòu)自美國(guó)ThermoFisher公司。TB Green PreMix Ex Taq II(Tli RNAseH Plus)購(gòu)自日本TaKaRa公司。

1.2 方法

1.2.1 hPDLSCs的培養(yǎng)和鑒定 牙周膜組織臨床標(biāo)本(n=10)采集于西北婦女兒童醫(yī)院口腔科收治的接受正畸治療的10名12～27歲健康人，均無(wú)牙周病。本研究已獲得西北婦女兒童醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號(hào)：No.2020-5-09-1007)，所有研究對(duì)象均簽署了知情同意書。收集10個(gè)因正畸治療拔除的健康第三磨牙或第一前磨牙，用0.01 mol/L的PBS沖洗牙齒，用刀片刮取根中1/3區(qū)域的牙周膜組織，將牙周膜組織剪成1 mm3左右的組織塊，然后貼在培養(yǎng)皿底部，并與30 ml α-MEM(其中含有10%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素)在37 ℃、5% CO2一起孵育。培養(yǎng)基每3 d更換1次。在細(xì)胞達(dá)到90%匯合后，用PBS沖洗細(xì)胞并用胰蛋白酶消化2 h。然后，將細(xì)胞以1 000 r/min離心5 min。棄去上清液后，將細(xì)胞重懸。培養(yǎng)基每3 d更新1次。細(xì)胞達(dá)到90%匯合后按1 ∶3的比例傳代。OLYMPUS TH4-200倒置顯微鏡下觀察hPDLSCs的形態(tài)，然后通過(guò)流式細(xì)胞儀鑒定hPDLSCs，方法如下：取第3代hPDLSCs胰蛋白酶消化，將細(xì)胞以1 200 r/min離心5 min，除去上清液。將細(xì)胞在PBS中稀釋至1×106個(gè)/ml。將100 μl細(xì)胞懸液分別與STRO-1(1 ∶500稀釋)、CD-146(1 ∶500稀釋)、CD34(1 ∶500稀釋)和CD45(1 ∶500稀釋)特異性一抗在4 ℃下孵育1 h，然后與FITC標(biāo)記的熒光二抗(1 ∶500稀釋)室溫孵育1 h。使用Beckman Coulter FC500流式細(xì)胞儀分析STRO-1、CD-146、CD34和CD45的陽(yáng)性細(xì)胞百分比。

1.2.2 hPDLSCs的增殖測(cè)定 通過(guò)MTT試劑盒檢測(cè)hPDLSCs的活性。將紫草素用0.1%二甲基亞砜(DMSO)溶解。然后將hPDLSCs在96孔板(5×103個(gè)細(xì)胞/孔)中與不同濃度的紫草素(0，0.1，1，10，100 μmol/L)在37 ℃、5%CO2條件下孵育24 h后，再與100 μl的MTT孵育4 h，棄去上清液，每孔加入100 μl的DMSO。用酶標(biāo)儀測(cè)定572 nm處的吸光度。

1.2.3 hPDLSCs的分組處理和成骨分化誘導(dǎo) hPDLSCs以5×103個(gè)細(xì)胞/孔的密度在96孔板中培養(yǎng)至80%匯合。然后，按照不同紫草素濃度將細(xì)胞分為5組，即0 μmol/L組、0.1 μmol/L組、1 μmol/L組、10 μmol/L組、100 μmol/L組。成骨誘導(dǎo)液為含有100 ml/L FBS、10 mmol/L β-甘油磷酸鈉、50 mg/L抗壞血酸和10 nmol/L地塞米松的α-MEM培養(yǎng)液，各組細(xì)胞分別用含有指定濃度的紫草素的成骨誘導(dǎo)液在37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)21 d，每2 d更換培養(yǎng)基。

1.2.4 hPDLSCs的堿性磷酸酶(ALP)染色和活性測(cè)定 在hPDLSCs用成骨分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基和紫草素聯(lián)合培養(yǎng)21 d后，將0.2% Triton-X100添加到hPDLSCs中，然后以10 000 r/min離心10 min。使用堿性磷酸酶染色試劑盒對(duì)hPDLSCs進(jìn)行染色。使用4%多聚甲醛固定細(xì)胞30 min后，用PBS洗滌hPDLSCs 3次。配制5 ml的染色工作液(2.5 ml 0.2 mol/L的Tris-HCl、3 mg FBBsalt、0.5 mg AS-MX、0.025 ml DMF，ddH2O定容至終體積為5 ml)。在黑暗中將工作液添加到hPDLSCs中避光孵育20 min。顯微鏡下觀察ALP染色。實(shí)驗(yàn)重復(fù)6次。使用堿性磷酸酶活性測(cè)定試劑盒檢測(cè)hPDLSCs中ALP活性。hPDLSCs用成骨分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基和紫草素聯(lián)合培養(yǎng)21 d后，除去培養(yǎng)液，PBS清洗3次，用RIPA細(xì)胞裂解液裂解hPDLSCs。10 000 r/min離心15 min后，吸取上清液并加入50 μl發(fā)色底物孵育10 min，再加入100 μl反應(yīng)停止液停止反應(yīng)。用酶標(biāo)儀檢測(cè)520 nm波長(zhǎng)處的OD值。

1.2.5 茜素紅染色觀察鈣化結(jié)節(jié) 在hPDLSCs用成骨分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基和紫草素聯(lián)合培養(yǎng)21 d后，4%多聚甲醛固定20 min，PBS洗3次。hPDLSCs用1 g/L茜素紅染色液在室溫下染色10 min，然后PBS沖洗3次。在倒置顯微鏡下觀察鈣化結(jié)節(jié)。使用1 ml 1%氯化十六烷基吡啶溶解鈣化結(jié)節(jié)，酶標(biāo)儀檢測(cè)590 nm波長(zhǎng)處的OD值。

1.2.6 qRT-PCR檢測(cè)成骨相關(guān)基因RUNX2、OCN和Smad4的轉(zhuǎn)錄水平 在hPDLSCs用成骨分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基和紫草素聯(lián)合培養(yǎng)21 d后，通過(guò)qRT-PCR測(cè)定hPDLSCs成骨分化過(guò)程中RUNX2、OCN和Smad4的mRNA表達(dá)。hPDLSCs的總RNA通過(guò)TRIzol總RNA提取緩沖液提取，裂解液用氯仿分離，并在4 ℃下12 000g離心15 min。然后，使用異丙醇沉淀裂解物，在4 ℃下12 000g離心10 min。DEPC洗滌裂解液沉淀后，重懸于75%乙醇中，4 ℃下12 000 r/min離心10 min，最后溶解于20 μl DEPC中。用Revertaid First Strand cDNA合成試劑盒合成cDNA。用TB Green PreMix Ex Taq II(Tli RNAseH Plus)在ABI 7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上進(jìn)行qRT-PCR。反應(yīng)條件：95 ℃ 2 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。β-actin作為內(nèi)參基因，用2-ΔΔCt法計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)水平。引物序列見(jiàn)表1。實(shí)驗(yàn)重復(fù)6次。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.2.7 Western blot檢測(cè)成骨相關(guān)蛋白R(shí)UNX2、OCN和Smad4的表達(dá)水平 在hPDLSCs用成骨分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基和紫草素聯(lián)合培養(yǎng)21 d后，通過(guò)Western blot測(cè)定RUNX2、OCN和Smad4的蛋白表達(dá)。使用含有1%苯甲基磺酰氟和1%磷酸酶抑制劑的RIPA裂解緩沖液裂解hPDLSCs，10 000 r/min離心10 min后，用BCA蛋白測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。然后將40 μg蛋白質(zhì)通過(guò)12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)在100 V下電泳90 min分離。然后，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上，室溫下將膜用5%脫脂牛奶封閉1 h。然后將膜與RUNX2(1 ∶1 000稀釋)、OCN(1 ∶500稀釋)、Smad4(1 ∶2 000稀釋)和β-actin(1 ∶2 000稀釋)一抗在4 ℃孵育過(guò)夜。然后將膜與山羊抗兔IgG H&L(HRP)二抗(1 ∶2 000稀釋)室溫孵育1 h。使用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光(ECL)底物試劑盒顯影。β-actin作為內(nèi)參蛋白。在Image J軟件上分析蛋白質(zhì)條帶的灰度值。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果

2.1 hPDLSCs的形態(tài)學(xué)觀察和鑒定

培養(yǎng)的hPDLSCs主要呈束狀長(zhǎng)梭形，少量呈橢圓形或紡錘形(見(jiàn)圖1)。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)hPDLSCs表面標(biāo)記物，結(jié)果顯示hPDLSCs中STRO-1(99.64%)和CD146(99.83%)主要為陽(yáng)性，CD34(0.11%)和CD45(1.04%)主要為陰性(見(jiàn)圖2)。證實(shí)分離的hPDLSCs具有干細(xì)胞特性。

圖1 倒置顯微鏡下的第3代hPDLSCs形態(tài) (×40)Figure 1 Morphology of 3rd generation hPDLSCs under inverted microscope (×40)

圖2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)hPDLSCs中STRO-1、CD146、CD34和CD45的表達(dá)Figure 2 Expression of STRO-1, CD146, CD34 and CD45 in hPDLSCs byflow cytometry

2.2 紫草素對(duì)hPDLSCs增殖的影響

各組間hPDLSCs的相對(duì)活力差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=29.614，P<0.001)，與0 μmol/L組相比，1 μmol/L組和10 μmol/L組hPDLSCs的相對(duì)細(xì)胞活力均升高(P<0.05)，分別升高了12.00%和23.31%；0.1 μmol/L組和100 μmol/L組hPDLSCs的相對(duì)細(xì)胞活力與0 μmol/L組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，見(jiàn)圖3)。

與0 μmol/L組比較，*P<0.05圖3 MTT法檢測(cè)不同濃度的紫草素對(duì)hPDLSCs增殖的影響Figure 3 Effect of different concentrations of shikonin on the proliferation of hPDLSCs by MTT

2.3 紫草素對(duì)hPDLSCs ALP染色和活性的影響

各組hPDLSCs的ALP染色結(jié)果顯示，1 μmol/L組和10 μmol/L組ALP染色較0 μmol/L組明顯更深(見(jiàn)圖4)。各組hPDLSCs的相對(duì)ALP活性差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=29.807，P<0.001)，與0 μmol/L組相比，1 μmol/L組和10 μmol/L組hPDLSCs的相對(duì)ALP活性均升高(P<0.05)，分別升高了12.32%和24.19%；0.1 μmol/L組和100 μmol/L組hPDLSCs的相對(duì)ALP活性與0 μmol/L組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，見(jiàn)圖4)。

圖4 不同濃度的紫草素對(duì)hPDLSCs中ALP活性的影響 (ALP染色，×200)Figure 4 Effect of different concentrations of shikonin on ALP activity in hPDLSCs (ALP staining，×200)

2.4 紫草素對(duì)hPDLSCs鈣化結(jié)節(jié)形成的影響

各組hPDLSCs的鈣化結(jié)節(jié)形成量(OD590 nm)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=12.500，P<0.001)，與0 μmol/L組相比，1 μmol/L組和10 μmol/L組hPDLSCs的鈣化結(jié)節(jié)形成量(OD590 nm)均升高(P<0.05)，分別升高了10.85%和24.63%；0.1 μmol/L組和100 μmol/L組hPDLSCs的鈣化結(jié)節(jié)形成量(OD590 nm)與0 μmol/L組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，見(jiàn)圖5)。

圖5 不同濃度的紫草素對(duì)hPDLSCs鈣化結(jié)節(jié)形成的影響 (茜素紅染色，×200)Figure 5 Effect of different concentrations of shikonin on the formation of calcified nodules in hPDLSCs (Alizarin red staining，×200)

2.5 紫草素對(duì)hPDLSCs中成骨相關(guān)基因和蛋白表達(dá)的影響

各組hPDLSCs中RUNX2(F=746.660，P<0.001)、OCN(F=767.637，P<0.001)和Smad4(F=729.021，P<0.001)mRNA水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與0 μmol/L組相比，1 μmol/L組和10 μmol/L組hPDLSCs的RUNX2、OCN和Smad4的mRNA水平均顯著升高(P<0.05)，100 μmol/L組Smad4的mRNA水平顯著降低(P<0.05)；0.1 μmol/L組和100 μmol/L組hPDLSCs的RUNX2和OCN的mRNA水平與0 μmol/L組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，見(jiàn)圖6)。

與0 μmol/L組比較，*P<0.05圖6 不同濃度的紫草素對(duì)hPDLSCs中成骨相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄的影響Figure 6 Effect of shikonin at different concentrations on the transcription of osteogenic genes in hPDLSCs

各組hPDLSCs中RUNX2(F=428.122，P<0.001)、OCN(F=1 417.675，P<0.001)和Smad4(F=1 322.665，P<0.001)蛋白表達(dá)水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與0 μmol/L組相比，1 μmol/L組和10 μmol/L組hPDLSCs中RUNX2、OCN和Smad4蛋白相對(duì)表達(dá)量均顯著升高(P<0.05)，100 μmol/L組Smad4蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著降低(P<0.05)。0.1 μmol/L組和100 μmol/L組hPDLSCs中RUNX2和OCN蛋白相對(duì)表達(dá)量與0 μmol/L組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，見(jiàn)圖7)。

與0 μmol/L組比較，*P<0.05圖7 Western blot檢測(cè)不同濃度的紫草素對(duì)hPDLSCs中成骨相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Figure 7 Effect of different concentrations of shikonin on the expression of osteogenic related proteins in hPDLSCs by Western blot

3 討論

本研究中分離的細(xì)胞主要呈束狀長(zhǎng)梭形，符合hPDLSCs的形態(tài)特征。Seo等[3]報(bào)道，hPDLSCs表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞表面抗原STRO-1及血管周圍細(xì)胞表面標(biāo)記物CD146。另外，CD34和CD45是造血干細(xì)胞表面抗原。本研究通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)了hPDLSCs中STRO-1、CD146、CD34和CD45的表達(dá)，結(jié)果顯示hPDLSCs中STRO-1和CD146為強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，CD34和CD45為強(qiáng)陰性表達(dá)。這表明所培養(yǎng)的細(xì)胞符合成體干細(xì)胞的特性。

hPDLSCs在牙周組織再生修復(fù)中的效果取決于其數(shù)量和功能活性，通過(guò)藥物處理來(lái)增加hPDLSCs的增殖和成骨分化將有助于提高h(yuǎn)PDLSCs在口腔醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用成功率，并且，已有文獻(xiàn)指出使用具有抗氧化、抗炎的物質(zhì)對(duì)干細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理可以影響它們優(yōu)先分化為特定的細(xì)胞譜系[13]。然而，目前臨床中缺乏有效的藥物。眾所周知，牙周病與過(guò)度炎癥有關(guān)，具有抗炎作用的藥物不僅可以起到抗炎作用，而且可能是牙周組織再生修復(fù)的輔助藥物。多項(xiàng)文獻(xiàn)報(bào)道了紫草素在多種細(xì)胞和疾病中的抗炎作用[8-10]，并且最近的文獻(xiàn)報(bào)道已經(jīng)確認(rèn)紫草素可抑制脂多糖誘導(dǎo)的人牙周膜細(xì)胞中的過(guò)度炎癥[12]。然而，尚無(wú)文獻(xiàn)探索紫草素對(duì)hPDLSCs增殖的影響，本研究表明，1 μmol/L和10 μmol/L的紫草素促進(jìn)了hPDLSCs的增殖，而當(dāng)濃度為0.1 μmol/L或100 μmol/L時(shí)，hPDLSCs的增殖未受影響，說(shuō)明合適濃度的紫草素具有促進(jìn)hPDLSCs增殖的作用。

成骨分化是牙周組織重建的關(guān)鍵步驟，成骨分化與ALP活性有直接的關(guān)系，并且涉及幾種成骨相關(guān)基因或蛋白的表達(dá)，其中包括RUNX2、OCN和Smad4。ALP活性增高可增加細(xì)胞內(nèi)游離的磷離子濃度，從而促進(jìn)鈣鹽沉積和鈣化結(jié)節(jié)的形成[14]。RUNX2是成骨和軟骨細(xì)胞分化和骨形成必不可少的重要轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)節(jié)多種相關(guān)成骨基因的轉(zhuǎn)錄、翻譯和定向分化[15]。RUNX2的缺失會(huì)降低小鼠的骨形成[16]。此外，RUNX2調(diào)節(jié)Ⅰ型膠原基因和ALP[17]。OCN也是另一種成骨分化基因，能夠和羥磷灰石結(jié)合并促進(jìn)骨的形成和礦化[18]，OCN的上調(diào)可反映PDLSCs中的成骨細(xì)胞表型[19]。有研究報(bào)道，Smad4通過(guò)與磷酸化的Smad1/5/8結(jié)合形成轉(zhuǎn)錄復(fù)合物來(lái)誘導(dǎo)其下游鈣化基因的表達(dá)[20]。Smad4的下調(diào)會(huì)降低RUNX2的表達(dá)和鈣化結(jié)節(jié)數(shù)，并抑制ALP活性，從而抑制成骨分化[21]。本研究檢測(cè)了紫草素對(duì)成骨分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)的hPDLSCs中ALP活性、鈣化結(jié)節(jié)形成和成骨相關(guān)基因和蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果表明，1 μmol/L和10 μmol/L的紫草素升高了hPDLSCs中ALP活性、促進(jìn)了鈣化結(jié)節(jié)形成，并上調(diào)了RUNX2、OCN和Smad4的轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)，而當(dāng)濃度為0.1 μmol/L或100 μmol/L時(shí)，則不能促進(jìn)hPDLSCs的成骨分化。因此，適當(dāng)濃度的紫草素可促進(jìn)hPDLSCs的成骨分化。

綜上所述，本研究表明適當(dāng)濃度的紫草素可促進(jìn)hPDLSCs的增殖和成骨分化。由于大多數(shù)牙周病為炎癥性疾病，過(guò)度的炎癥可導(dǎo)致牙周組織無(wú)法再生[22]，因此具有抗炎作用的紫草素可能是牙周組織再生修復(fù)中具有重要的潛在應(yīng)用價(jià)值。