化學萃取同種異體肌腱重建兔跟腱缺損的研究

陳國飛，薛小華，蔡繁繁，陳侯磬，羅鵬，江長青，郭偉明

（1.華中科技大學協和深圳醫院 運動醫學科，廣東 深圳 518052；2.中國科學院大學深圳醫院創傷骨關節科，廣東 深圳 518000）

跟腱損傷是常見的運動損傷，常因外傷引起。跟腱缺損常見于二次損傷或跟腱感染，需要外科手術治療[1]。跟腱缺損常用的外科手術方式為V-Y翻轉或肌腱移植。V-Y翻轉成形術損傷大[2]，肌腱移植可選用自體肌腱及異體肌腱，自體肌腱需二次創傷，應用同種異體肌腱移植修復陳舊性跟腱斷裂，根據缺損長短可提前制作供材，不僅減少了自體肌腱取材時造成的二次損傷及其引起的相關并發癥，并且簡化了手術方法，縮短了手術時間[3]。本次研究化學萃取同種異體肌腱在跟腱缺損移植中應用的可行性。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及主要試劑、儀器

成年雄性新西蘭大白兔45只，體重2.5～3.0kg，由北京華富康有限公司提供。將動物分成四組，其中一組將15只兔處死后取出雙側肌腱進行化學萃取處理，再將處理后肌腱回植至剩余30只兔子跟腱缺損處，并將兔子分成三組，每組10只，分別于術后6周、12周、24周抽取外周血并處死后取出移植肌腱進行組織學及生物力學對比。

1.2 跟腱取材及化學萃取

取材：新西蘭大白兔予7%水合氯醛于耳緣靜脈注射麻醉，后腿備皮，剪開腿部皮膚，暴露肌肉組織以及肌腱，分離肌肉充分暴露肌腱，剪下肌腱，注意避免操作過程中夾取或牽拉肌腱。

萃取方法：⑴100mL滅菌蒸餾水中水平振蕩6h，滅菌蒸餾水沖洗三遍；⑵4%Triton X-100約100 mL中水平振蕩12 h，滅菌蒸餾水沖洗三遍；⑶滅菌蒸餾水100 mL中水平振蕩6 h，滅菌蒸餾水沖洗三遍；⑷4%脫氧膽酸鈉液約100 mL中水平振蕩12 h，滅菌蒸餾水沖洗三遍；⑸滅菌蒸餾水100mL中水平振蕩12h。

1.3 跟腱損傷模型建立

將剩余的30只兔子腹腔注射7%水合氯醛（0.5 mL/100 g）麻醉后，將兔子后腿消毒刮毛，切開跟腱外層皮膚4.0 cm，分層顯露皮下組織，顯露兔跟腱處，切除跟腱2.0 cm，制作跟腱缺損，再將已制備好的萃取同種異體肌腱移植至跟腱缺損處，縫合固定連接同種異體肌腱，沖洗傷口，縫合切口。術后將手術的后腿用管型石膏固定于屈曲40°位。

所有兔子術后均在實驗動物中心按標準飼養，晝夜規律正常。術后動物無不明原因死亡、自殘、傷口感染、跖底潰瘍等現象。術后3周將石膏外固定去除，任其自由活動。在術后6周、12周、24周時，分別隨機取6只移植組動物處死后取出移植肌腱用于觀察實驗結果。

1.4 實驗觀察指標

1.4.1 大體觀察指標

觀察兔手術后傷口愈合情況、術后肢體的活動度、行走步態，并在取標本時觀察移植肌腱縫合處愈合情況及大體形態。

1.4.2 組織學檢查

將標本取出后，將未移植的萃取后跟腱組織和移植后不同時期的體內異體跟腱，進行病理切片、HE染色，Masson及電鏡觀察不同時期和不同種類的跟腱及縫合口的組織學變化。

1.4.3 免疫源性檢測

分別于術后6周、12周、24周抽取三組動物的外周血2 mL，然后在EDTA-K2抗凝管中放置混勻，在4℃的溫度下冷藏保存備用，檢測時間控制在2 h內。添加并混合8μL的抗體D4(CT-4)FITC和8μL的抗體CD8-α(CT-8)FITC。標記，將5μL的雞血加入其中，在37℃孵育箱中進行1 h的避光孵育。對紅細胞進行裂解。上機對CD4+、CD8+T淋巴細胞數進行檢測。

1.4.4 生物力學檢測

移植肌腱拉伸斷裂強度檢測中，肌腱兩端用紗布包裹，然后將其固定在檢測儀兩端，檢測時用生理鹽水不斷噴濕肌腱，防止風干對實驗結果造成影響。將肌腱拉伸至完全斷裂，拉伸速度為10 mm/min，在肌腱拉伸斷裂檢測過程中，用相應軟件詳細記錄結果；在檢測肌腱拉伸斷裂延伸率過程中，延伸率計算方法為（拉伸斷裂長度-初始長度）/初始長度×100%[4]。

1.5 統計學方法

2 結果

2.1 大體觀察結果

兔跟腱在移植后2周內可見術側無法行走，呈跛行狀態，3周后拆除石膏并拆線，可觸及皮下跟腱，有連續性。行走狀態較前改善，但術側活動幅度較對側明顯降低，肌力低于正常。4周后，仍步態異常，速度慢。皮下肌腱觸及可推動，肌腱增粗增大，肌腹腱連續性存在。雙后肢活動幅度仍較正常降低，肌力較前增強。8周時兔可正常行走，步態無明顯異常，速度仍較正常組慢，可輕松地推動皮下跟腱，連續性好。24周后兔術側跟腱連續性好，無活動障礙，肌力正常。

從大體形態上，3周拆除石膏后，跟腱連續性存在，6周時移植跟腱增生，未觸及明顯增粗，12周時可觸及明顯瘢痕硬組織，24周后形態接近正常組織，無明顯硬化及增粗。

2.2 組織切片觀察結果

6周時組織病理切片可見少許血管增生長入，肌腱組織結構排列紊亂，連續性存在；8周時肌腱組織排列較整齊，可有膠原纖維長入，伴有局部壞死區；24周后可見腱組織排列整齊，腱束內未見明顯壞死組織。

2.3 生物力學檢測

生物力學檢測結果見表1。

表1 生物力學檢測結果（±s）

表1 生物力學檢測結果（±s）

組別 拉伸強度（M P a） 最大拉伸（m m） 斷裂伸長率（%）6周 1 5 9.0 0±3 5.0 0 2.6 9±0.8 9 1 8.8 6±1.3 7 1 2周 1 6 8.0 0±3 1.0 0 2.8 0±0.5 0 2 0.3 2±1.2 8 2 4周 1 7 6.0 0±2 3.0 0 3.3 1±0.7 4 2 2.0 4±1.3 1 P值 0.0 0 2 0.0 0 0 0.0 0 0

2.4 HE染色對比

在400X顯微鏡下，從6周開始可見同種異體肌腱組織內有細胞組織長入，12周細胞核逐漸增多，24周內肌腱組織HE染色可見肌腱內布滿細胞核（圖1-3）。

圖1-3 400×顯微鏡下6周見細胞組織長入;12周見細胞核逐漸增多；24周見布滿細胞核

2.5 免疫源性檢測

6周、12周和24周檢測外周血CD+4、CD+8T淋巴細胞計數所占比例及CD+4/CD+8比值，任兩組間差異均有統計學意義（P＜0.05，表2）。

表2 免疫源性檢測結果（±s）

表2 免疫源性檢測結果（±s）

組別 C D+4 C D+8 C D+4/C D+8 6周 3 5.0±7.0 1 3.2±1.2 2.4±0.2 1 2周 3 1.0±7.0 1 4.5±1.1 2.1±0.1 2 4周 2 6.0±7.0 1 6.3±1.5 1.5±0.3 P值 0.0 0 1 0.0 0 0 0.0 0 0

2.6 Masson染色觀察

術后6周、12周、24周分別取肌腱標本，常規行Masson染色觀察肌腱內纖維組織情況。通過觀察可見，隨著時間的延長，化學萃取肌腱內纖維組織增多，排列更有序緊湊（圖4-6）。

圖4-6 6周、12周、24周肌腱內顯微組織情況

2.7 利用電鏡掃描

觀察6周、12周、24周化學萃取異體肌腱在電鏡微觀下的結構，通過電鏡掃描可見纖維組織膠原纖維隨時間推移增多（圖7-9）。

圖7-9 電子顯微鏡掃描(2 000×)見顯微組織膠原纖維變化

3 討論

跟腱損傷常見于運動損傷，目前的主要治療方式為外科手術。對于伴有跟腱缺損的手術方式可選擇肌腱移植[4-5]，肌腱來源包括自體肌腱及同種異體肌腱。自體肌腱雖無排斥反應[6]，但來源有限，難以滿足臨床需求，且取自體肌腱會增加患者創傷。而同種異體肌腱來源廣泛，能夠滿足臨床需求，但其應用面臨免疫排斥反應的問題[7-8]，目前采用的同種異體肌腱均為處理后無抗原移植物。同種異體肌腱的選擇需要肌腱纖維結構，具備破壞小、力學結構穩定特點。而采用化學萃取后同種異體肌腱既處理了抗原，又能夠較好地保留肌腱的生物力學性能，是作為跟腱缺損后移植重建的較好選擇。

肌腱的愈合可以分為炎癥期、增殖期和重塑期。炎癥期在受傷后不久發生，組織形成血腫，細胞通過這些血腫進行傳遞[9]。而異體移植的肌腱主要經歷壞死、血管化、細胞增值、塑形階段。在移植早期可見到化學萃取異體肌腱移植后出現纖維結構的溶解，很少有細胞長入，并且肌腱移植后會出現纖維瘢痕增生，隨后進入細胞增殖期。而到了移植中期，這時肌腱會開始增粗，肌腱中的Ⅲ型膠原蛋白隨后逐漸被Ⅰ型膠原蛋白替代，可見到移植細胞的長入，通過HE染色以及電子纖維鏡下可見移植肌腱上有較多的細胞長入，使其更為牢固。大約12周后，成熟階段開始，主要是膠原纖維的不斷交聯和形成腱組織實質[10]。在本實驗中的第12周肌腱明顯增粗，而隨著時間的推移，肌腱的愈合會進入重塑期，重塑期又包括兩個階段：鞏固期和成熟期[11]。重塑期肌腱會變得更有韌性和彈性，而且塑形后的肌腱變得柔軟，接近正常的跟腱組織，力學性能也能更加接近原有的跟腱組織。后期HE染色觀察可見化學萃取后肌腱內布滿了細胞核。24周時，從電鏡下觀察細胞的長入是最多的。

根據研究表明，CD4+T、CD8+T兩個淋巴細胞亞群參與機體免疫排斥反應主要是通過細胞免疫和體液免疫兩個過程協同作用[12]。二者比值的變化常作為移植后排斥反應的指標[13]，化學萃取肌腱移植后不同時間的淋巴細胞轉化率均有明顯差異，在移植后6周時的轉化率最大，第24周的轉化率明顯低于其他組，第12周的轉化率明顯低于第一組，說明隨著移植后時間的推移，移植后的肌腱細胞免疫原性越來越低，隨著自體細胞的長入替代，移植后的肌腱組織逐漸形成自體肌腱。

從力學結構上，最初化學萃取后的肌腱組織在彈性模量和最大負荷是最小的，隨著移植后時間的推移，肌腱的彈性模量和最大負荷都在增加，24周后達到最大值，不同時間組之間具有統計學差異。而到12周以后，與24周的差異較小，說明隨著時間推移，移植肌腱在細胞長入后力學性能逐漸穩定。

綜上所述，化學萃取法同種異體肌腱既保留了原有的纖維機構和生物力學性能，又降低了免疫原性，可為臨床提供良好的供材。