建立ELISA法檢測胸膜液GSDMD及其對胸腔積液鑒別診斷的價值①

史 靜 袁 源 陳 紅 周麗菁 甘德露 陳維賢 李 樸

（重慶醫科大學附屬第一醫院檢驗科，重慶 400042）

胸腔積液（pleural effusion，PE）是以胸膜腔內病理性液體積聚為特征的一種常見臨床癥候，當患者全身狀況、肺部疾病、器官功能障礙等病理過程導致胸膜液形成和吸收不平衡時通常會產生PE。結核性肺炎、肺部感染和惡性肺部疾病是PE最常見的原因［1］。臨床檢驗工作中常采用病原菌檢測、生化和免疫分析PE 以區分其病因。對于結核性PE，結核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，Mtb）涂片染色法是目前確診Mtb的金標準，但敏感度有限，培養Mtb 需數周時間，且需要較高的實驗室條件。乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）與類肺炎性PE、結核性胸膜炎或惡性PE 有關，故LDH 在鑒別PE 病因方面缺乏特異性和敏感度［2］。一份針對63 項研究的Meta 分析結果顯示，腺苷脫氨酶（adenosine eaminase，ADA）診斷結核性胸膜炎平均敏感度和特異性分別為0.92 和0.90［3］。但最近一項研究發現，ADA 水平雖然在胸膜結核診斷中效率較高，但在結核組和惡性組鑒別診斷中可能無明顯作用［4］。且ADA在低患病率環境下的診斷效果不理想［5］。故探索更經濟、高效和檢測方法可行的生物標志物尤其重要。

焦亡（pyroptosis）是一種由caspase-1 或caspase-11/4/5 激活的炎癥性程序性細胞死亡途徑［5］。Gasdermin——焦孔素（包括6 個同源基因GSDMA、GSDMB、GSDMC、GSDMD、GSDME、PJVK）是一個具有成孔效應的蛋白家族，可影響膜通透性和細胞焦亡。目前研究表明，GSDMD 是細胞焦亡的執行者。GSDMD 被激活的caspase 切割，產生1 個GSDMD-N端片段和1 個GSDMD-C 端調控域。GSDMD-N 在焦亡過程中寡聚并插入細胞膜，形成氣孔，最終導致焦亡［6-7］。此外，還存在一種鈣依賴的膜修復反應，由轉運必需內體分選復合物（endosomal sorting com‐plexes required for transport Ⅲ，ESCRTⅢ）介導，通過去除GSDMD 膜孔維持細胞膜完整性，從而抑制細胞滲透性裂解［8］。如果這一機制是抑制GSDMD 膜孔介導的細胞死亡的一種常見反應，那么無細胞的上清中可能含有GSDMD，為GSDMD 作為一種新的胞外炎癥性體液生物標志物提供了理論基礎［9］。

目前PE 中GSDMD 的定量檢測尚未見報道，GSDMD 水平與PE 相關疾病的關系仍不清楚。因此，本研究旨在通過建立臨床常用的ELISA檢測法，探討胸膜液中GSDMD 用于鑒別胸膜液病因的臨床價值。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 研究對象 選取重慶醫科大學附屬第二醫院2018 年10 月至2019 年11 月于呼吸內科就診的患者161 例，包括漏出性PE 30 例（對照組）、結核性PE 40 例（結核組）、惡性PE 48 例（惡性組）、感染性PE 43 例（感染組）。結核性胸膜炎中的結核病診斷和治療根據《全球結核病報告》指南診斷。惡性組取自非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）患者，遵循國家綜合癌癥網絡發布的診療指南診斷和治療。本研究不包括合并肺癌和結核性肺炎患者。感染組患者標準：①滲出物與細菌性肺炎、肺膿腫或支氣管擴張有關；②以炎癥性胸膜炎、慢性膿胸或胸膜纖維化、斑塊為表現，胸膜液未見Mtb者。不屬于上述任何一種類型的滲出性PE歸入“漏出性”組。本研究按照《赫爾辛基宣言》原則進行，經重慶醫科大學第二附屬醫院醫學倫理委員會批準。按照標準操作規程采集PE，并立即轉入臨床試驗室。取胸膜液室溫15 000 r/min 離心10 min，收集上清，?80 ℃保存待檢。本研究受試者臨床特征見表1。

表1 PE患者生化和細胞學特征（±s）Tab.1 Biochemical and cytological characteristics in PE patients（±s）

表1 PE患者生化和細胞學特征（±s）Tab.1 Biochemical and cytological characteristics in PE patients（±s）

Characteristics n Male/Female Age/year GSDMD/（ng·ml?1）LDH/（U·L?1）ADA/（U·L?1）Tuberculosis（TPE）40 23/17 54.77±12.64 45.56±24.57 395.40±283.92 40.34±16.61 Malignant（MPE）48 26/22 63.66±10.03 24.43±16.31 381.26±292.34 17.03±9.68 Infection（PPE）43 23/20 54.09±12.29 26.27±17.79 183.26±71.09 14.68±7.04 Control 30 18/12 56.70±11.54 5.50±4.28 217.47±159.58 7.15±4.16

1.1.2 試劑與儀器 GSDMD 單克隆抗體、HRP 酶標抗體（兔抗人免疫球蛋白IgG 抗體，美國Abcam）；Corning 96孔酶標板（美國Thermo Fisher Scientific）；ELISA 試劑盒（北京萬泰）；ADA 和LDH 檢測試劑盒（四川Maccura）；MultiskanTMFC 微平板閱讀器（美國Thermo Scientific）；7600 自動生化分析儀（日本日立）；IMMULITE?1000 化學發光免疫分析儀（德國西門子）。

1.2 方法

1.2.1 GSDMD ELISA 檢測法建立 采用單項滴定法確定酶標板上包被抗體濃度，將抗GSDMD 單克隆抗體梯度稀釋，以陽性參考品和陰性參考品代替樣本，測定OD 值。陽性參考品OD 值>1.0，陰性參考品OD<0.2 為包被最適濃度。100μl 最適濃度的抗GSDMD 單克隆抗體4 ℃包被過夜，次日甩干洗滌后加入5%脫脂牛奶250 μl 封閉，將待測樣本加至孔中37 ℃孵育2 h，甩干，含0.1%Tween20的磷酸鹽緩沖液洗滌5 次，加入抗GSDMD 多克隆抗體37 ℃孵育1 h，甩干，PBST洗滌3次，每次浸泡2 min，再加入HRP酶標抗體（兔抗人免疫球蛋白IgG）37 ℃孵育30 min，拍干洗板，加入底物TMB 100 μl 37 ℃孵育15 min，加入50 μl 終止液（1 mol/L H2SO4），5 min 內采用MultiskanTMFC 微平板閱讀器測量450 nm 處OD值。

1.2.2 標準曲線繪制 將商品化GSDMD 抗原標準品（2 000 pg/ml）倍數稀釋，得到濃度為2 000~15.6 pg/ml 的一系列標準品。各濃度標準品重復檢測2 次，以超純水為空白孔樣本，OD 差值=實驗孔OD 值?空白對照孔OD 值，繪制系列標準品GSDMD濃度和OD差值的標準曲線。

1.2.3 方法學評價 重復性試驗：取濃度分別為500、250、125、62.5、31.2 pg/ml 的5 個標準品，批內變異系數采用同批酶標板測定5 次；批間變異系數采用3 批不同時間包被的酶標板測量5 次。干擾試驗：隨機選擇5 份陽性無溶血和黃疸GSDMD 樣本，加入一定量（1.2、2.4 和4.8 g/L）血紅蛋白和（70、140 和280 μmol/L）膽紅素，再次檢測GSDMD濃度，進行配對檢驗，Graphpad Prism 5.0 軟件繪制柱狀圖。

1.2.4 胸膜液指標檢測 采用ELISA 試劑盒按照制造商說明檢測IFN-γ水平。7600自動生化分析儀檢測ADA 和LDH 活性，IMMULITE?1000 化學發光免疫分析儀檢測IL-1β水平。

1.3 統計學方法 ELISA 方法學評價包括線性范圍、檢測限確定、批內和批間變異系數及干擾試驗。采用SPSS20.0 軟件分析數據。連續變量以±s表示，比較采用t檢驗，兩組間比較采用單因素方差分析。本研究所有檢驗均為雙尾，P<0.05為差異有統計學意義。GSDMD、LDH、ADA 及3 種生物標志物聯合診斷的準確性采用受試者操作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線評價，計算特異性、敏感度和曲線下面積（area under the curve，AUC），濃度臨界值（cut-off）以最大約登指數計算［10］。

2 結果

2.1 ELISA 法檢測GSDMD 方法學建立和評價 當包被抗體濃度為1μg/ml時為最適包被濃度（此時陽性參考品OD>1.0，陰性參考品OD<0.2）。以標準品濃度（15.6、31.2、62.5、125、250、500、1 000、1 500 和2 000 pg/ml）的自然對數為橫坐標，OD 差值為縱坐標，繪制濃度與OD 差值曲線（圖1A）。當GSDMD 濃度為31.2~250 pg/ml 或250~2 000 pg/ml時，OD 差值接近線性，分別對以上GSDMD 標準濃度的自然對數和OD差值制作標準曲線（圖1B）。標準曲線回歸方程：①y=0.036 8x+0.041 9（31.2~250 pg/ml，R2=0.954 1），x=ln（X）；②y=0.292 8x?1.388 6（250~2 000 pg/ml，R2=0.996 6），x=ln（X）。其檢測限為31.2 pg/ml，批內和批間變異系數分別為5.65%和8.63%（表2）。抗干擾能力評價：濃度膽紅素（280 μmol/L）和血紅蛋白（4.8 g/L）干擾下，GSDMD濃度差異無統計學意義（P>0.05，圖2）。

表2 批內和批間重復性實驗Tab.2 Intra-batch and inter-batch repeatability

圖1 GSDMD 標準品濃度的自然對數與OD 差值曲線圖及標準曲線Fig.1 Difference curve and standard curve between natural logarithm and OD of GSDMD standard substance concentration

圖2 膽紅素（A）和血紅蛋白（B）干擾實驗Fig.2 Bilirubin（A）and hemoglobin（B）interference ex?periments

2.2 PE 中GSDMD、ADA 與LDH 表達的相關性分析 本研究檢測患者PE 標本中GSDMD、ADA 和LDH 水平，并對其含量進行相關性分析。包含所有患者時，3 個生物標志物差異有統計學意義。PE 中GSDMD 含量與ADA 呈正相關（r=0.389 8，P<0.001，圖3）。

圖3 相關性分析Fig.3 Correlation analysis

2.3 GSDMD 對不同類型PE 的鑒別診斷價值 結核組、惡性組、感染組和對照組GSDMD 濃度差異均有統計學意義（P均<0.000 1，圖4）。GSDMD 在區分漏出性PE 和惡性PE（AUC=0.947）、結核性PE（AUC=0.998）及感染性PE（AUC=0.951）中具有較高診斷能力，而ADA AUC 分別為0.874、0.945 和0.826，LDH AUC為0.716、0.794和0.524。GSDMD鑒別漏出性PE 和結核性PE 的AUC 水平最高，cut-off值為16.007 ng/ml，靈敏度為100.0%，特異度為96.7%。與ADA 和LDH 相比，GSDMD 在鑒別滲出性PE 與惡性PE、結核性PE 和感染性PE 的診斷靈敏度最高。在鑒別結核性PE 與惡性PE 時，相比于GSDMD（AUC=0.835），ADA的診斷性能略高（AUC=0.845）。在惡性組與感染組、結核組與感染組及結核組與惡性組中的鑒別診斷性能，ADA 和LDH 優于GSDMD（表3）。

圖4 各組GSDMD、ADA和LDH表達及診斷效能Fig.4 GSDMD，ADA and LDH expressions and diagnosis in each group

表3 生物標志物鑒別PE的AUC值Tab.3 Value of AUC of biomarkers for PE antidiastole

2.4 GSDMD、ADA 和LDH 聯合檢測對PE 鑒別診斷的價值 GSDMD、ADA 和LDH 聯合檢測結果顯示，其在對照組與惡性組（AUC=0.953）、對照組與感染組（AUC=0.987）、結核組與惡性組（AUC=0.915）具有更高鑒別診斷能力（表4）。3種指標聯用時診斷特異性和敏感度均高于單一生物標志物。

表4 GSDMD、ADA、LDH聯合鑒別診斷PE的效能Tab.4 Diagnostic value of combined detection of GSD?MD，ADA and LDH for PE antidiastole

3 討論

焦亡是一種病理原因導致的依賴于caspase 的細胞死亡類型，以磷脂酰絲氨酸接觸、孔形成、細胞膜破裂、胞質內容物分泌（包括IL-1β、LDH和IL-18）為特點［7］。近年多項研究表明，不同病理刺激，如感染性疾病（包括普通細菌及Mtb、神經系統疾病、癌癥等）均可引起焦亡［9-16］。焦亡主要發生于單核細胞和巨噬細胞，誘導溶解性細胞死亡［17］。近期研究顯示，一種鈣依賴的膜修復機制——ESCRTⅢ可拮抗焦亡［8］。作為進化上保守的觸發細胞膜修復的機制，鈣通量通過溶酶體等囊泡胞吐、膜附件蛋白動員及ESCRT 機制修復細胞膜損傷［18］。基于這一膜修復機制，無細胞培養上清中將檢測到GSDMD［6］。此外，焦亡是一種細胞溶解性死亡方式，細胞膜破裂后，GSDMD 可能大量釋放。以上研究為PE 可檢出GSDMD提供了理論依據。

GSDMD-N結構域導致的孔隙會引起細胞焦亡，但也會產生超活性細胞，其GSDMD 孔隙數少于焦亡細胞［19］。焦亡過程中，細胞膜破裂、胞質蛋白釋放、超活性細胞亦會釋放胞質蛋白。已有研究證實，孔隙形成蛋白GSDMD 可調節過度活躍的巨噬細胞釋放IL-1，提示GSDMD可能成為比其他炎癥性生物標志物敏感度更高的指標［20-24］。近年越來越多的生物標志物被用于PE 鑒別診斷，如IL-27 用于結核性PE 診斷的靈敏度為96.1%，CXCL9 為97.7%，CXCL11 為95.4%，以及新型生物標志物CD44等［22-24］。而GSDMD 用于診斷結核性PE 的靈敏度高達100%，在PE早期診斷中起不可或缺的作用。

本研究觀察到GSDMD 在不同病理條件下伴有不同程度升高，GSDMD 鑒別漏出性PE 和其他病理性PE 的AUC 值均>0.94。GSDMD AUC 平均值為0.965，而ADA為0.882，LDH為0.678。可見GSDMD在鑒別漏出性PE和其他病理性PE方面的診斷效能高于ADA 和LDH。GSDMD 區分漏出性PE 和結核性PE 的敏感度和特異性分別為100.0%和96.7%（AUC=0.990），cut-off 值為16.007 ng/ml。GSDMD不僅在結核性PE鑒別診斷方面表現出明顯優勢，且在結核性PE 和惡性PE 鑒別（AUC=0.835）、結核性PE 和感染性PE 鑒別（AUC=0.806）中也表現良好。本研究也依據最高的診斷準確率計算了GSDMD 的cut-off 值。雖然GSDMD 在PE 鑒別診斷中還存在一些不足，如惡性PE 與感染性PE 鑒別、結核性PE 與感染性PE鑒別，但GSDMD仍具有良好的診斷性能，且GSDMD、ADA 和LDH 3 種指標聯用進一步提高了診斷能力。

本研究建立的GSDMD ELISA 法最低檢出限可達到31.5 pg/ml，抗血紅蛋白（4.8 g/L）和膽紅素（280μmol/L）干擾性較好。低濃度范圍的標準曲線相關性不理想（R2=0.954 1），批間變異系數較大（15.1%），可能是ELISA 檢測易受干擾所致，需更多研究探索更好的檢測條件或其他更穩定靈敏的檢測方法。總之，采用間接雙抗夾心ELISA 法檢測PE GSDMD，簡單易行，靈敏度高，線性范圍廣，可在一般醫院開展。

本研究仍有一些局限性。首先，納入人群有限，可能導致結果偏倚。此外，很難排除PE 的誤分類，尤其是漏出性PE 和感染性PE。同時PE 采集仍是一種有創檢測，血清正常GSDMD 水平有待進一步明確。

綜上，本研究建立了ELISA定量檢測PE GSDMD的方法，并探討了GSDMD 在不同類型PE（包括漏出性、結核性、惡性和感染性PE）鑒別診斷中的臨床價值。GSDMD 濃度不僅可作為一種新的PE鑒別診斷生物標志物，具有較高診斷敏感度，且可與ADA 和LDH結合進一步提高診斷能力。