熊果酸對妊娠期糖尿病大鼠胰島素抵抗的作用

張 藝，朱 燕，南 燕

1.鄭州市第七人民醫院婦產科，鄭州 450000；2.新鄉醫學院第三附屬醫院婦產科，新鄉 453003

妊娠期糖尿病(GDM)是一種常見且嚴重的妊娠并發癥，多數情況下，GDM是機體發生慢性胰島素抵抗導致胰島β細胞功能障礙而使葡萄糖耐量受損的結果[1-2]。熊果酸是一種五環三萜類化合物，存在于自然界多種藥用植物及果實中，具有抗炎、抗癌、抗糖尿病、抗氧化和抗菌等多種生物活性[3-5]。研究表明，熊果酸對糖尿病及糖尿病相關并發癥有一定治療作用[6-7]。本研究用一次性腹腔注射STZ法建立了大鼠GDM模型，旨在探究熊果酸對GDM的作用及機制。

1 儀器與材料

1.1 儀器

血糖儀(江蘇魚躍醫療設備股份有限公司)；雙板垂直電泳儀、轉印電泳儀和凝膠成像儀(北京六一儀器廠)；倒置顯微鏡(日本Olympus公司)；酶標儀(美國Thermo Fisher Scientific公司)。

1.2 試藥

熊果酸(質量分數>98%，美國Sigma-Aldrich公司，批號U6753)；二甲雙胍(中美上海施貴寶制藥有限公司，批號B14202103081)；鏈脲佐菌素(STZ，批號S8050))、超氧化物歧化酶(SOD)活性檢測試劑盒(批號BC0170)、丙二醛(MDA)含量檢測試劑盒(批號BC0025)、蘇木精(批號H8070)、伊紅(批號G1100)、TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒(批號T2190)，均購自北京索萊寶科技有限公司；過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)測定試劑盒(批號：A007-1-1、A005-1-2)，均購自南京建成生物工程研究所；磷酸化磷酯酰肌醇-3-激酶(p-PI3K，批號17366)、磷酯酰肌醇-3-激酶(PI3K，批號4249)、磷酸化蛋白激酶B(p-Akt，批號4060)和蛋白激酶B(Akt，批號4691)，均購自美國CST公司。

1.3 動物

8周齡SPF級SD大鼠，雌性70只，雄性35只，體質量均為200～220 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。

2 方法

2.1 建模與分組

參考邢寶恒等[8]的方法建立GDM孕鼠模型。選取未交配處于動情期的雌鼠及雄鼠以2∶1的比例同籠，次日早上9: 00檢查雌鼠陰道分泌物，若鏡檢存在精子即確定為妊娠，將妊娠成功大鼠隨機分為5組，分別為正常組、模型組、二甲雙胍組、熊果酸高和低劑量組，每組14只。確定妊娠的第5天，除正常組大鼠外均腹腔注射35 mg·kg-1STZ溶液，若72 h后空腹血糖(FBG)值≥13.5 mmol·L-1，則表明GDM孕鼠模型建立成功，正常組大鼠腹腔注射等量生理鹽水。

2.2 給藥方法

確定妊娠的當天給藥，熊果酸高、低劑量組大鼠分別灌胃100、50 mg·kg-1熊果酸，二甲雙胍組大鼠灌胃200 mg·kg-1二甲雙胍，模型組和正常組大鼠灌胃等量蒸餾水，每天1次，連續19 d。

2.3 檢測指標與方法

2.3.1樣本采集 給藥結束后，大鼠提前12 h禁食不禁水，尾靜脈采1 mL血液樣本用于FBG、空腹胰島素(FINS)和胰島素抵抗指數(HOMA-IR)檢測。各組孕鼠稱定質量，并剖取胎鼠、稱定胎盤并記錄其質量，分離胰腺組織，一部分置于多聚甲醛溶液(40 g·L-1)中固定用于制作病理切片，剩余部分凍存于-80 ℃超低溫冰箱中，用于細胞因子及蛋白表達檢測。

2.3.2FBG及HOMA-IR檢測 血糖儀檢測FBG，試劑盒檢測FINS，并計算HOMA-IR(HOMA-IR=FBG×FINS/22.5)。

2.3.3SOD、CAT、GSH-Px活力及MDA含量檢測 取胰腺組織置于研磨器中低溫勻漿，以10 000 r·min-1離心10 min取上清，嚴格按照試劑盒說明書步驟檢測各氧化應激指標的水平變化。

2.3.4HE染色 胰腺組織固定48 h后取出，脫蠟至水，制作厚度為4 μm的石蠟組織切片，進行常規HE染色、封片，在光鏡下觀察胰腺組織病變。

2.3.5TUNEL染色 取2.3.4中制作的石蠟組織切片，按照TUNEL檢測試劑盒說明書步驟進行染色、封片，置于熒光顯微鏡下觀察胰腺組織中細胞凋亡情況，計算細胞凋亡指數(AI)，AI=(凋亡細胞數/胰島細胞總數)×100%。

2.3.6Western blot 取胰腺組織置于研磨器中勻漿，加入RIPA和PMSF提取組織蛋白，BCA法測定蛋白質量濃度，將蛋白作變性處理后進行SDS-PAGE電泳，濕轉至PVDF膜，封閉2 h，4 ℃孵育p-PI3K(1∶1 000)、PI3K(1∶1 000)、p-Akt(1∶800)和Akt(1∶800)一抗稀釋液，過夜后洗膜，37 ℃孵育二抗(1∶1 000)，再次清洗后滴加發光試劑，放入凝膠成像儀中成像，Image J軟件對各個目的蛋白灰度值進行量化，計算蛋白相對表達量，蛋白相對表達量=目的蛋白灰度值/內參蛋白灰度值。

3 結果

3.1 熊果酸對FBG、FINS及HOMA-IR的影響

模型組孕鼠FBG、HOMA-IR顯著高于正常組，而FINS顯著低于正常組(P<0.05)。二甲雙胍組、熊果酸高、低劑量組孕鼠FBG、HOMA-IR低于模型組，FINS高于模型組(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠FBG、FINS及HOMA-IR水平比較

3.2 熊果酸對孕鼠、胎鼠和胎盤質量的影響

模型組孕鼠體質量、胎鼠和胎盤質量均顯著高于正常組(P<0.05)。二甲雙胍組、熊果酸高、低劑量組孕鼠體質量、胎鼠和胎盤質量均顯著低于模型組(P<0.05)。見表2。

表2 各組孕鼠、胎鼠和胎盤質量比較

3.3 熊果酸對胰腺活力的影響

模型組孕鼠胰腺SOD、CAT及GSH-Px活力較正常組顯著降低，MDA含量較正常組顯著升高(P<0.05)。二甲雙胍組、熊果酸高劑量及低劑量組孕鼠胰腺SOD、CAT及GSH-Px活力與模型組比較有所提高，MDA含量則低于模型組(P<0.05)。見表3。

表3 各組孕鼠氧化應激指標比較

3.4 熊果酸對胰腺組織病變的影響

HE染色顯示，正常組孕鼠胰島組織結構正常、完整，胰島細胞排列整齊，分布均勻。模型組孕鼠的胰島組織損傷明顯，可見細胞排列紊亂、稀疏，邊界不清，數量減少，有炎癥細胞浸潤。用藥物干預后，二甲雙胍組、熊果酸高及低劑量組胰島組織損傷得到改善，組織結構均勻、整齊，細胞數量增加，細胞核和細胞質清晰可見，炎癥浸潤現象減輕。見圖1。

注：A.正常組；B.模型組；C.二甲雙胍組；D.熊果酸高劑量組；E.熊果酸低劑量組。

3.5 熊果酸對胰島細胞凋亡的影響

由TUNEL染色結果可見，正常組孕鼠胰島組織偶見凋亡細胞，模型組孕鼠胰島組織中則可見大量的凋亡細胞，AI指數明顯升高(P<0.05)，使用藥物干預后，二甲雙胍組、熊果酸高及低劑量組胰島組織中的凋亡細胞明顯減少，AI指數降低(P<0.05)。見圖2、表4。

注：A.正常組；B.模型組；C.二甲雙胍組；D.熊果酸高劑量組；E.熊果酸低劑量組。

表4 各組孕鼠胰島細胞凋亡情況比較

3.6 熊果酸對胰腺組織相關蛋白表達的影響

Western blot結果顯示，模型組胰腺組織PI3K、Akt蛋白磷酸化水平低于正常組(P<0.05)。用藥物干預后，二甲雙胍組、熊果酸高、低劑量組胰島組織PI3K、Akt蛋白磷酸化水平較模型組有明顯升高(P<0.05)。見圖3、表5。

注：A.正常組；B.模型組；C.二甲雙胍組；D.熊果酸高劑量組；E.熊果酸低劑量組。

表5 各組孕鼠胰腺組織蛋白表達比較

4 討論

GDM是妊娠期常見的代謝并發癥之一，患有GDM的女性在晚年發生糖尿病和心血管疾病的風險比正常女性高[9-10]。GDM患者后代患巨大兒、新生兒低血糖、高膽紅素血癥及新生兒呼吸窘迫綜合征以及兒童期肥胖和成年期心血管疾病的風險亦顯著增加[11]。GDM的發病與胰島素抵抗密切相關，高胰島素抵抗的GDM患者具有更加不良的代謝，也具有更高的不良妊娠結局風險[12]。本研究通過腹腔注射STZ建立了GDM大鼠模型，檢測結果顯示，模型組孕鼠的FBG、HOMA-IR顯著升高，而FINS顯著降低，且孕鼠體質量、胎鼠和胎盤質量均顯著升高，病理切片染色結果顯示胰島組織損傷明顯，凋亡細胞增加，表明孕鼠GDM模型建立成功，存在胰島素抵抗和胰島組織受損。

熊果酸是一類具有多種藥理學活性的五環三萜類化合物。阮勇等[13]研究發現，熊果酸可降低糖尿病大鼠的血糖、血脂水平，并能改善肝腎功能。BACANLI M等[14]研究發現，熊果酸可顯著改善糖尿病大鼠引起的腎損傷。在本研究中，經過熊果酸干預后，孕鼠FBG、HOMA-IR降低，FINS升高，孕鼠體質量、胎鼠和胎盤質量降低，表明熊果酸可改善GDM孕鼠胰島素抵抗，減輕GDM相關肥胖及胎兒超重。HE染色顯示，熊果酸改善了胰島組織損傷，并減輕炎癥浸潤，TUNEL染色也顯示，胰島細胞凋亡減少，表明熊果酸可改善GDM導致的胰島損傷和炎癥浸潤。正常的葡萄糖穩態需要大量健康且功能正常的胰腺β細胞來維持，氧化應激通過多種分子機制損害β細胞功能，減少胰島素的產生，誘導胰腺細胞的凋亡過程，導致胰島β細胞死亡和數量減少，加重胰島素抵抗[15-18]。在本研究中，模型組孕鼠胰腺SOD、CAT及GSH-Px活力顯著降低，MDA含量顯著升高，用熊果酸處理后，孕鼠胰腺SOD、CAT及GSH-Px活力有所提高，MDA含量降低，表明熊果酸可減輕GDM誘導的氧化應激損傷。

PI3K/Akt信號通路存在于體內各個器官，在多種生理功能中發揮著重要作用[19]。在生理條件下，飯后分泌的胰島素激活PI3K/Akt信號通路，增加葡萄糖利用量，減少肝臟和肌肉中的糖異生，調節脂質和葡萄糖代謝平衡，PI3K/Akt通路的激活可減輕肥胖和胰島素抵抗[20]。而在肥胖和Ⅱ型糖尿病中，胰島素介導的PI3K/Akt通路被阻斷，減少了胰島素分泌，降低胰島β細胞功能，并影響著其他組織進一步加劇了胰島素抵抗[21-22]。在本研究中，模型組孕鼠胰腺組織PI3K、Akt蛋白磷酸化水平降低，經過熊果酸處理后，與模型組比較，GDM孕鼠胰島組織PI3K、Akt蛋白磷酸化水平升高，表明熊果酸可能通過激活PI3K/Akt信號通路改善GDM大鼠胰島素抵抗。

綜上所述，熊果酸可改善GDM孕鼠胰島素抵抗和胰島組織損傷，降低GDM孕鼠體質量、胎鼠和胎盤質量，減輕氧化應激，其機制可能與激活PI3K/Akt信號通路有關。