Siglec-15在唑來膦酸特異性γδ T細胞的表達及與抗原提呈相關分子表達的關系①

游紅琴 黃正華 朱會芳 韓 露 李林霖 高全立

（鄭州大學附屬腫瘤醫院，河南省腫瘤醫院，鄭州 450008）

γδ T細胞是外周血中數量較少的CD3+T淋巴細胞亞群，兼具固有免疫和適應性免疫應答特點［1］。γδ T細胞對抗原的識別無主要組織相容性復合體限制性，活化時對共刺激分子信號依賴較少，可在腫瘤發生早期迅速識別多種抗原，如脂質、蛋白質和膦抗原，啟動免疫應答［2-4］。經膦抗原激活的γδ T細胞一方面分泌IFN-γ、顆粒酶和穿孔素等效應分子發揮效應細胞功能［5］；另一方面與成熟的樹突狀細胞類似，表達抗原提呈分子人類白細胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）-DR和共刺激分子CD80及CD86，發揮專職抗原提呈細胞（antigen presenting cell，APC）功能，對抗原進行加工處理并向初始狀態的αβ T細胞提呈抗原，誘導腫瘤特異性細胞毒性T細胞產生［6］。

近期研究發現，唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素家族成員唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素-15（sialic acid-binding immunoglobulin-like lectin 15，Siglec-15）在腫瘤組織浸潤巨噬細胞中表達上調，進而抑制由巨噬細胞發起的適應性免疫應答［7］。Siglec-15在發揮APC功能的γδ T細胞中的表達特點尚無報道，為此，本研究擬從γδ T細胞發揮抗原提呈功能的角度，探索Siglec-15在唑來膦酸（zoledronate，ZOL）激活的γδ T細胞表達特點，分析Siglec-15與共刺激分子CD80、CD86和抗原提呈相關分子HLA-DR在γδ T細胞中表達水平的關系，為今后臨床應用γδ T細胞治療肺癌提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1材料 淋巴細胞分離液購自美國GE公司；GT-T551 H3培養基購自寶日醫生物技術（北京）有限公司；ZOL購自揚子江藥業集團；重組人IL-2購自山東泉港藥業有限公司；抗人Siglec-15抗體購自上海近岸科技有限公司；流式抗體BV510標記anti-TCRγδ、FITC標記anti-CD3、PE標記anti-CD80、PE/cy7標記anti-CD86和Percp-cy5.5標記anti-HLA-DR均購自美國Biolegend公司；Fortessa流式細胞分析儀和FlowJo V10流式分析軟件購自美國BD公司。

1.2方法

1.2.1γδ T細胞的體外培養 收集4例健康對照（healthy control，HC）和5例肺癌患者（lung cancer，LC）外周血，血液標本為2019年12月至2020年7月河南省腫瘤醫院免疫治療科GMP實驗室收治的臨床檢測標本。空腹抽取外周靜脈血3 ml于EDTA采血管，2 000 r/min離心10 min（溫度22℃，離心半徑10 cm），取離心后的自體血漿滅活備用。全血細胞經無血清培養基1∶1稀釋后，使用淋巴細胞分離液以2 000 r/min離心20 min（溫度22℃，離心半徑10 cm）吸取白膜層。以無血清培養基重懸細胞，1 500 r/min離心10 min（溫度22℃，離心半徑10 cm）去除血小板。再次以無血清培養基重懸細胞，1 200 r/min離心8 min（溫度22℃，離心半徑10 cm）獲取外周血單個核細胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）。用含3%自體血漿的GT-T551-H3培養基調整細胞濃度為1×106個/ml，分別添加ZOL（濃度為1μmol/L）和IL-2（400 U/ml），將細胞懸液移入48孔板（1 ml/孔），于37℃、含5%CO2的培養箱中培養。培養至第5天時進行第1次傳代，將生長狀態良好的細胞在培養第6～16天期間每天補液，每隔2 d傳代1次。

1.2.2流式細胞術檢測Siglec-15、CD80、CD86和HLA-DR在γδ T細胞中的表達 分別取培養前及培養后第4、8、12、16天的細胞懸液，1 500 r/min離心（溫度22℃，離心半徑10 cm）5 min后，使用含2%胎牛血清的PBS溶液重懸，洗滌1次；調整細胞濃度為1×107個/ml，每管200 μl，用含1%人血白蛋白的PBS溶液室溫封閉細胞5 min，1 500 r/min離心（溫度22℃，離心半徑10 cm）5 min；加入抗人Siglec-15抗體，4℃孵育60 min，用含2%胎牛血清的PBS溶液洗滌2次；加入APC標記二抗，4℃避光孵育30 min，含2%胎牛血清的PBS溶液洗滌2次；加入BV510標記anti-TCRγδ、FITC標 記anti-CD3、PE標 記anti-CD80、PE/cy7標 記anti-CD86和Percp-cy5.5標 記anti-HLA-DR抗體，4℃避光孵育30 min。使用含2%胎牛血清的PBS洗滌2次，重懸于300 μl含2%胎牛血清的PBS，進行流式檢測。

1.3統計學方法 實驗數據均采用SPSS19.0軟件進行統計學分析。數據為計量資料，服從正態分布，數值以±s表示。獨立數據組間比較采用單因素t檢驗；相關性分析采用Spearman法，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1CD80、CD86、HLA-DR和Siglec-15在ZOL激活γδ T細胞的表達 以流式細胞術分析CD80、CD86、HLA-DR及Siglec-15在ZOL刺激前及刺激后不同時間點γδ T細胞的表達（圖1）。ZOL刺激前，HC和LC外周血中表達CD80、CD86、HLA-DR和Siglec-15的γδ T細胞比例均較低；隨ZOL刺激時間的增加，HC和LC外周血中CD80+γδ T細胞水平出現相似變化趨勢：在刺激后4 d升高，刺激后8 d持續升高，刺激后12 d達到峰值；刺激后16 d，CD80+γδ T細胞比例仍保持在高水平。在ZOL刺激前及刺激后的不同時間點，CD80+γδ T細胞水平在兩組間差異均無統計學意義（圖2A）。共刺激分子CD86在HC和LC外周血γδ T細胞的表達水平呈先升高后降低特點，ZOL刺激后4 d升高，且HC組CD86+γδ T細胞水平顯著高于LC組；刺激后8 d達峰值；刺激后12 d后，CD86+γδ T細胞水平降低，刺激后16 d繼續下降（圖2B）。抗原提呈相關分子HLA-DR在HC和LC外周血γδ T細胞的表達水平呈先升高后降低趨勢，ZOL刺激后4 d升高，且HC組的HLA-DR+γδ T細胞水平顯著高于LC組；刺激后8 d持續升高，刺激后12 d達到峰值；ZOL刺激后16 d，HLA-DR+γδ T細胞比例下降（圖2C）。ZOL刺激后4 d，Siglec-15+γδ T細胞水平在HC組上調至峰值，顯著高于LC組；刺激后8 d，Siglec-15+γδ T細胞水平在HC組降低，LC組Siglec-15+γδ T細胞水平上調達峰值；刺激后12 d，兩組Siglec-15+γδ T細胞水平均降低；刺激后16 d，表達Siglec-15的γδ T細胞比例降至基線水平（圖2D）。

圖1 流式細胞術分析CD80、CD86、HLA-DR及Siglec-15表達Fig.1 Expressions of CD80，CD86，HLA-DR and Siglec-15 were analyzed by flow cytometry

圖2 CD80、CD86、HLA-DR和Siglec-15在ZOL激活γδ T細胞的表達Fig.2 Expressions of CD80，CD86，HLA-DR and Siglec-15 on γδ T cells activated by ZOL

2.2Siglec-15與CD80、CD86和HLA-DR在ZOL激活γδ T細胞表達水平的相關性 相關性分析表明，HC組的Siglec-15+γδ T細胞與CD80+、CD86+和HLADR+γδ T細胞比例在各檢測時間點均未表現出相關性（圖3）；LC組Siglec-15+γδ T細胞與CD80+γδ T細胞比例在ZOL刺激前及刺激后的4 d和8 d呈正相關（圖4A）；與CD86+γδ T細胞的比例在各檢測時間點均未表現出相關性（圖4B）；與HLA-DR+γδ T細胞比例在ZOL刺激前呈正相關（圖4C）。

圖3 正常對照組Siglec-15與CD80、CD86和HLA-DR在ZOL特異性γδ T細胞表達水平的相關性Fig.3 Correlation of Siglec-15 with CD80，CD86 and HLA-DR expression levels on ZOL specific γδ T cells in HC group

圖4 肺 癌 患 者Siglec-15與CD80、CD86和HLA-DR在ZOL特異性γδ T細胞表達水平的相關性Fig.4 Correlation of Siglec-15 with CD80，CD86 and HLA-DR expression levels on ZOL specific γδ T cells in LC patients

3 討論

除傳統手術和放療外，過繼免疫治療也是肺癌領域研究的熱點之一［8］。γδ T細胞發揮免疫監視和抗腫瘤作用，在肺癌細胞治療方面有廣泛的臨床應用前景［9-10］。既往研究發現膦抗原活化的γδ T細胞表達高水平的抗原提呈相關分子HLA-DR及共刺激分子CD80、CD86和CD40。表達上述分子的γδ T細胞可向αβ T細胞提呈抗原，刺激αβ T細胞的活化及對腫瘤細胞的殺傷，提示膦抗原激活的γδ T細胞可發揮APC功能，提供初始T細胞活化所需的抗原信號和共刺激信號，介導αβ T細胞針對特異性抗原的免疫應答［11］。

陳列平教授團隊研究發現Siglec-15可表達于發揮抗原提呈功能的巨噬細胞表面［12］。本研究以ZOL刺激PBMC，探索抗原提呈相關分子HLA-DR、共刺激分子CD80、CD86和Siglec-15在活化（刺激后0～4 d）及增殖階段（刺激后5～16 d）γδ T細胞的表達特點。與既往文獻報道一致，HC和LC外周血中γδ T細胞被ZOL激活后，在γδ T細胞的活化和增殖階段均表達高水平的抗原提呈相關分子HLA-DR、共刺激分子CD80和CD86。上述研究提示ZOL激活的γδ T細胞具備提呈抗原能力。在HC中，表達Siglec-15的γδ T細胞比例在活化階段顯著升高，進入增殖階段后下降至基線水平。LC的外周血中，表達Siglec-15的γδ T細胞水平在早期增殖階段出現峰值，之后下降至基線水平。隨著ZOL刺激時間的延長，Siglec-15在兩組γδ T細胞的表達水平均呈先升后降趨勢。本研究進一步分析了Siglec-15與CD80、CD86和HLA-DR在γδ T細胞表達水平的關系。發現Siglec-15和CD80在肺癌外周血γδ T細胞的表達水平在ZOL刺激前及刺激后的4 d和8 d均呈正相關，提示在γδ T細胞表達CD80提供T細胞活化所需的第二信號時，Siglec-15的表達水平隨之上調，推測Siglec-15可能與CD86發揮協同功能，即向活化的T細胞傳導抑制信號，從而避免T細胞過度激活。上述結果提示ZOL在賦予γδ T細胞抗原提呈能力的同時通過上調Siglec-15表達水平抑制其觸發的適應性免疫應答，這是機體免疫系統維持免疫穩態的一種調控方式。

綜上所述，本研究發現Siglec-15在ZOL特異性γδ T細胞的表達水平先升高后降低，表達水平的上調與CD80表達水平的升高有關。該結果對臨床應用γδ T細胞的抗原提呈功能治療肺癌具有一定的參考價值。