一種基于植物瞬時表達研制新冠病毒重組蛋白疫苗的方法①

王弘瑞 趙麗娟 房明麗 楊 明（吉林大學基礎醫學院分子生物學教研室，長春 130021）

新型冠狀病毒又稱為嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒2（SARS-CoV-2），是一種單鏈正股RNA病毒，可引起致命的呼吸道感染，造成肺部炎癥，又稱新冠肺炎（COVID-19）［1-2］。COVID-19具有傳播速度快，潛伏期長，發病率高等特點，對全球范圍內的公共衛生和人類生命安全已造成嚴重的威脅［3-4］。截至目前，COVID-19疫情已經持續了2年多，然而由于COVID-19疫苗的產能不足及病毒的變異特點，世界各地的衛生組織和國家依然處于努力控制COVID-19傳播的狀態［5］。

SARS-CoV-2表面的刺突（S）蛋白上的受體結合區（receptor binding domain，RBD）能識別宿主細胞膜上的血管緊張素轉化酶2（angiotensin converting enzyme，ACE2）介導病毒入侵宿主細胞，S蛋白對于病毒與細胞受體的結合及與細胞膜的融合均發揮關鍵作用［6-7］。目前，用于人群接種的幾種COVID-19疫苗，均是以SARS-CoV-2的S蛋白作為靶點［8］。如mRNA疫苗、腺病毒載體疫苗及滅活病毒疫苗等，均能在一定程度上誘導抗S蛋白的中和抗體，阻斷SARS-CoV-2對機體的侵染［9］。然而這幾種疫苗也表現出了一定的限制性，如mRNA疫苗的成本高且不易保存；腺病毒載體疫苗易引發血栓問題［10］；滅活病毒疫苗的有效性和安全性也有待進一步提高［11］。相比之下，重組蛋白疫苗具有更為平衡的有效性和安全性，且成本較低。對于SARS-CoV-2的重組蛋白疫苗生產的主要問題在于如何選擇一種高效且快速的表達系統［12］。

常見的蛋白表達系統有原核表達系統、酵母表達系統、昆蟲細胞表達系統、哺乳動物細胞表達系統及植物表達系統等。植物的蛋白表達系統相比于傳統系統具有很多優點，如高效、快速、低成本及易擴大化生產等［13］。在植物表達系統中，可以根據外源基因所在位置可將植物表達系統分為轉基因植物穩定表達以及植物瞬時表達系統［14］。盡管轉基因植物有穩定轉化的優點，但生產穩定表達的轉基因植物品系費時費力，而且生物安全法規也禁止在野地中種植轉基因植物［15］。因此，采用植物瞬時表達系統來表達蛋白則是一種更為快速有效的方法。目前比較成熟的方法是利用根癌農桿菌（Agrobacterium tumefaciens）將外源質粒DNA滲透到植物細胞中進行快速表達［16］。采用農桿菌滲透法不僅可在短時間內獲得非常高的蛋白質積累，而且還消除了環境污染的風險［17］。因此，基于植物瞬時表達系統的高產、快速和生物安全性等特點，其成為了基礎研究和重組蛋白疫苗工業化生產等多種應用的最佳選擇之一。

利用農桿菌滲透法可以將目的基因導入到植物細胞中進行瞬時表達。本氏煙草（Nicotiana benthamiana）因其具有全面的生物學特性、產量高、多種表達載體相容性好以及易滲透等優點，可作為瞬時表達重組蛋白的首選植物［18］。采用上述方法進行瞬時表達的蛋白質通常會在農桿菌滲透后4～8 d達到積累高峰。此后，通過收獲植物葉片，從中提取目的蛋白并進行純化［19］。而純化的重組蛋白疫苗進一步通過生化和免疫學鑒定后，可在動物模型中進行功能檢測來評估其有效性［20］。本研究設計一種采用本氏煙草來瞬時表達的SARS-CoV-2 S重組蛋白疫苗生產方案，并對此過程和結果進行了詳細闡述。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗試劑SARS-CoV-2 S重組蛋白基因的根癌農桿菌GV3101菌株購自北京博邁生物有限公司，質粒系自行構建；羧芐青霉素（Carbenicillin）和利福平（Rifampicin）均購自北京博奧拓達科技有限公司；酵母提取物營養肉湯（YenB）培養基（0.75%酵母提取物和0.8%營養肉湯，pH=7.0）、瓊脂粉均購自青島高科技工業園海博生物技術有限公司；2-嗎啉乙磺酸（MES）緩沖液（pH=5.5）購自美國Sigma公 司；PBS緩 沖 液（pH=5.2）、苯 甲 基 磺 酰 氟（PMSF）、鎳離子金屬螯合親和層析介質（Ni-NTA）、葡聚糖凝膠G-25、咪唑緩沖液、His-tag抗體、Sepharose和sephedex-G25層析介質均購自美國GE Healthcare公司。本氏煙草植物種子由吉林大學農學部劉金亮教授饋贈；育苗塊購自壽光益園中科農資公司）；水溶性肥料購自春天農資公司；育苗盒購自蘇州純氧園藝設施公司。

1.1.2實驗儀器及場地721s可見光分光光度計（Lengquang Tech公司）；臺式恒溫振蕩器（上海習仁科學儀器有限公司）；人工氣候植物培養室（博易智匯科技北京有限公司建造）；勻漿機（上海凈信實業發展有限公司）；離心機（湖南湘立科學儀器有限公司）。

1.2方法

1.2.1植物煙草的培養 將育苗塊置于育苗盒中，加入約2 L去離子水，浸泡2 h，使育苗塊完全吸水膨脹。向育苗塊的中心播種2～4粒本氏煙草種子，并添加去離子水至育苗塊底部約1/4處，然后將育苗箱放置于人工氣候培養室中，恒溫25℃，相對濕度60%～80%，16 h/8 h的光照條件。約3周后，去除育苗盒蓋，加入2 L（濃度為1.48 g/L）的水溶性肥料繼續培養，在后續生長過程中，保持每2～3 d施肥1次。當煙草植物在生長第5周時，選擇5片生長旺盛且分布均勻的葉片留下，并摘除其他葉片。當煙草生長到第6周時，葉片生長到接近手掌大小，可用于下一步的農桿菌滲透。

1.2.2SARS-CoV-2 S重組蛋白農桿菌滲透液的制備 構建并培養包含SARS-CoV-2 S重組蛋白編碼基因的農桿菌，制備農桿菌滲透液。首先，構建包含SARS-CoV-2 S重組質粒的農桿菌：將SARS-CoV-2 S蛋白N末端區域（NTD）中的部分片段與RBD融合，并在其C段加入His-tag便于純化，隨后將該融合蛋白的編碼基因連接到MagnICON植物瞬時表達載體中，并轉化入農桿菌GV3101中，從而獲得含有的目的基因的農桿菌。

將攜帶有目的基因的農桿菌菌株接種于含羧芐青霉素（100 μg/ml）和利福平（333 μg/ml）的5 ml YenB液體培養基中，30℃以200 r/min的條件搖床培養24 h，直到OD600達到1.0。次日，將5 ml菌液接種于新的100 ml YenB液體培養基中繼續培養約16 h，使其OD600值達到1.5～1.8。收集菌液，6 000 g離心15 min，棄上清，得到細菌沉淀，10 ml pH=5.5的MES緩沖液重懸細菌沉淀，并測量其OD600值。根據其OD600值用MES緩沖液進一步稀釋。

1.2.3農桿菌滲透煙葉瞬時表達SARS-CoV-2 S重組蛋白 需提前12 h左右將待滲透的煙草轉移到普通室溫環境下，葉片輕度脫水有助于液體的滲透。隨后，將制備好的農桿菌滲透液倒入燒杯中，每次用注射器吸取大約10 ml的農桿菌液用于滲透。選擇待滲透的目標葉片，用針頭輕輕在葉片上刺穿1個小孔，然后將注射器的噴嘴對準小孔，緩慢推動注射器，讓葉片慢慢吸收滲透液。此外，可以在葉子上挑選多個位點來進行滲透，以達到將葉片完全滲透的目的。完成滲透后，添加去離子水至育苗塊底部約1/3處，隨后將育苗盤放回植物培養室，并監測煙草葉片的生長狀況。

1.2.4SARS-CoV-2 S重組蛋白的分離、純化及鑒定 需要從滲透后的煙葉中提取和純化SARS-CoV-2 S重組蛋白，并進行初步鑒定。煙葉中SARS-CoV-2 S重組蛋白的粗提：收獲滲透后第7天的煙葉，去除葉莖，留下兩側的葉片。將葉片和1.5倍體積的勻漿液（含2 mmol/L PMSF的PBS，pH=5.2）倒入勻漿機中，高速攪拌約2 min。接下來，將葉片勻漿液經棉質紗布過濾轉移入250 ml離心桶中，過濾過程需小心用紗布包裹勻漿，輕輕擠壓。將收集的過濾液在4℃下離心30 min（15 000 g），離心2次，隨后調整pH=5.2，4℃冰箱中過夜，此過程是基于等電點沉淀法來沉淀植物蛋白核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶（RuBisCO）。接下來，同樣的離心條件去除沉淀后的RuBisCO，將上清液pH值調回到7.0，再次離心處理。最后將離心獲得的上清液經0.45μm的過濾器處理，獲得粗步提純的SARS-CoV-2 S重組蛋白液。SARS-CoV-2 S重組蛋白純化與鑒定：將粗步提純的SARS-CoV-2 S重組蛋白液經過鎳離子親和層析柱，基于鎳離子與帶His-tag蛋白的結合來進行純化；接下來，對洗脫的蛋白進一步采取分子篩層析（Sephedex G-25）去除咪唑等小分子，最后，對純化的SARS-CoV-2 S重組蛋白進行SDS-PAGE和Western blot分析。

2 結果

2.1植物煙草的獲得 培養煙草可以為農桿菌的滲透提供健康葉片，用于重組蛋白的表達。如圖1A、B所示，將育苗箱放置于人工氣候培養室中，維持在恒溫25℃，相對濕度為60%～80%，16 h/8 h的光照條件。約3周后，去掉育苗盒蓋，保持每2～3 d施肥1次，如圖1C所示。當煙草生長到第6周時，葉片生長到接近手掌大小，如圖1D所示，可用于下一步的農桿菌滲透。

圖1 人工氣候室中植物煙草的培育過程Fig.1 Cultivation process of tobacco plants in artificial climate chamber

2.2獲得SARS-CoV-2 S重組蛋白農桿菌滲透液構建 如圖2所示構建SARS-CoV-2 S重組蛋白疫苗的農桿菌。一般來說，用于滲透葉片的單一農桿菌的OD600≤0.1。通過上述流程成功獲得可用于表達SARS-CoV-2 S重組蛋白的農桿菌滲透液。

圖2 構建SARS-CoV-2 S重組蛋白疫苗的農桿菌示意圖Fig.2 Schematic diagram of Agrobacterium tumefaciens for constructing SARS-CoV-2 S recombinant protein vaccine

2.3農桿菌滲透煙葉瞬時SARS-CoV-2 S重組蛋白的表達 采用注射滲透法，將SARS-CoV-2 S重組蛋白農桿菌注射到煙葉中，來表達目的蛋白（如圖3），葉子呈現出了更深的顏色，表面煙葉已成功完成滲透。在小規模的實驗室中，常用的農桿菌滲透法為注射滲透法，它可植物葉片的多個位點進行滲透，使植物葉片的利用率更高。該方法可在短時間內獲得非常高的蛋白質積累。

圖3 農桿菌注射滲透法過程Fig.3 Syringe-infiltration process of Agrobacterium tumefaciens

2.4分離、純化及鑒定SARS-CoV-2 S重組蛋白將粗步提純的SARS-CoV-2 S重組蛋白液經過鎳離子親和層析柱，對洗脫的蛋白進一步采取分子篩層析最終獲得純化后的目的蛋白，見圖4A。對純化的SARS-CoV-2 S重組蛋白進行SDS-PAGE和Western blot分析，結果如圖4B、C，采用植物煙草成功的表達SARS-CoV-2 S重組蛋白，其分子量約為53.2 kD，顯示His-tag抗體可以很好地識別SARS-CoV-2 S重組蛋白。

圖4 SARS-CoV-2 S重組蛋白的純化及SDS-PAGE和Western blot分析Fig.4 Purification of SARS-CoV-2 S recombinant protein and SDS-PAGE with Western blot analysis

采用植物煙草瞬時表達SARS-CoV-2 S重組蛋白可快速獲得大量所需的目的蛋白，產量約為500μg/g新鮮葉片，表達量遠高于常見的哺乳動物表達系統。

3 討論

目前，用于重組蛋白生產的表達系統有很多，但各有其優缺點。比如，原核表達系統表達的蛋白質缺乏足夠的翻譯后修飾，常影響蛋白疫苗的免疫原性；而酵母、昆蟲及哺乳動物細胞表達系統在進行大量蛋白生產時，需投入大量資金來完善其基礎設施，從而增加了成本［21］。本研究介紹的基于植物的瞬時蛋白表達系統對于原核表達系統、酵母表達系統、昆蟲細胞表達系統及哺乳動物細胞表達系統等傳統表達系統而言，具有多種優點，如高效、快速、低成本、不攜帶動物病原體及易擴大化生產等［22］。同時，植物表達系統還可對蛋白質進行必要的翻譯后修飾，有助于維持蛋白質的結構穩定和正常功能。此外，隨著瞬時表達載體技術的飛躍發展，植物瞬時表達系統的靈活性和生產速度是哺乳動物或昆蟲細胞表達系統所無法比擬的。

表達載體的選擇是植物瞬時表達系統中非常關鍵的一環。近年來基于“解構病毒”策略研發的植物病毒表達載體因其能快速生產高水平重組蛋白的優勢而備受青睞。此外，“解構病毒”載體在提高生物安全性，降低環境風險等方面也有一定的優勢［23］。常用的“解構病毒”載體包括“MagnICON”和“Geminiviral”等。“MagnICON”載體是一種基于煙草花葉病毒和馬鈴薯X病毒基因組序列的RNA復制載體。為了在植物中瞬時表達重組蛋白，需要將目的基因克隆到“MagnICON”載體中，然后將這種攜帶目的基因的植物病毒載體轉化入根癌農桿菌中［24］。既往研究表明，采用“MagnICON”植物病毒載體進行瞬時表達，每克新鮮葉片可以在接種后的4～8 d內生產出多達5 mg的重組蛋白，是目前已知的植物表達水平最高的一種“解構病毒”載體［25］。因此，植物瞬時表達系統快速且高效表達蛋白的能力使其有望成為生產突發傳染性疾病如SARS-CoV-2蛋白類疫苗的表達系統之一。