IL-18在膿毒癥肺損傷發生發展過程中的作用及機制研究①

董 巖 李 方 賈依娜爾 楊立新 權榮喜

（新疆醫科大學附屬腫瘤醫院重癥醫學科，烏魯木齊 830011）

膿毒癥指由感染因素導致的全身炎癥反應綜合征（systemic inflammatory response syndrome，SIRS），常見原因包括嚴重創傷、燒傷、再灌注損傷及外科大手術后的并發癥等［1］。嚴重膿毒癥患者可并發多器官功能損傷，而肺作為膿毒癥的主要受損器官，最常見并發癥為急性肺損傷（acute lung injury，ALI）［2］。ALI常見臨床表現為進行性低氧血癥和呼吸窘迫，若病情進一步發展將導致急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）［3］。ALI發病機制復雜，其中炎癥反應爆發和失控是ALI發病的核心環節，而既往研究認為ALI發生發展與Th1/Th2免疫失衡相關［4］。近年研究發現，調節性T細胞（regulatory T cell，Treg）與輔 助性T細 胞17（helper T 17 cell，Th17）及其細胞因子同樣在ALI發病機制中發揮重要作用［5-6］。Treg/Th17失衡學說受到越來越多的學者重視，不僅是對Th1/Th2失衡機制的補充，更為ALI發生發展提供了更多免疫學依據。IL-18是由多種細胞（如單核細胞、血管平滑肌細胞及內皮細胞等）產生的具有多項效應的促炎因子，既往研究發現其可誘導T細胞及自然殺傷細胞產生IFN-γ，在抗感染、免疫調節、抗腫瘤及慢性炎癥等疾病過程中發揮重要作用［7］。研究發現，IL-18在膿毒癥重癥患者中的表達顯著增加，且與患者不良預后密切相關［8-9］。最近研究顯示，IL-18在絕經后骨質疏松癥小鼠模型中能夠通過調控Treg/Th17及炎癥因子表達影響成骨細胞分化［10］。而在膿毒癥中高表達的IL-18能否通過影響Treg/Th17平衡參與ALI發生發展尚無報道。本研究將采用IL-18基因敲除（IL-18-/-）小鼠以LPS誘導經典膿毒癥模型，觀察IL-18對ALI的影響及機制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 清潔級雄性C57BL/6小鼠36只，6～8周齡，體質量22～30 g，購自新疆醫科大學實驗動物中心。IL-18基因敲除小鼠（IL-18-/-）由蘇州賽業生物公司訂制。均飼養于SPF級動物房，自由飲食飲水，飼養環境：22～26℃，40%～70%相對濕度，12 h/12 h晝夜交替。本研究所涉及動物實驗均符合新疆醫科大學附屬腫瘤醫院醫學倫理委員會要求，所有操作遵循實驗動物操作管理規范。

1.1.2主要試劑 脂多糖（LPS，美國Sigma公司）；DMEM培養液（美國Hyclone公司）；佛波酯（PMA）/離子霉素混合物、布雷菲德菌素A（BFA，杭州聯科生物）；大鼠抗IL-18、STAT3、磷酸化STAT3（p-STAT3）單克隆抗體、GAPDH（美國Abcam公司）；辣根過氧化酶（HRP）標記的二抗（廣州晶彩）；RORγδ、FoxP3（美國Santa Cruz公司）；Alexa Fluor 647標記的兔抗大鼠抗體（美國Biolegend公司）；TUNEL凋亡檢測試劑盒（美國Roche公司）；4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染料、HE染色試劑盒、BCA蛋白試劑盒（江蘇碧云天生物公司）；FITC-CD4、APC-25、PE-Cy5.5-IL-17A、PE-FoxP3（美國BD公司）；PCR試劑盒（日本TaKaRa）；PCR引物由上海生工合成；其他試劑均為國產分析純。

1.2方法

1.2.1膿毒癥動物模型構建 實驗小鼠分為4組：野生型小鼠對照組（WT組，n=6）、LPS處理的野生型小鼠組（WT LPS組，n=10）、IL-18基因敲除的小鼠對照組（IL-18-/-組，n=10）、LPS處理的IL-18基因敲除小鼠組（IL-18-/-LPS組、n=10）。小鼠適應性喂養1周，術前12 h禁食不禁水，腹腔注射LPS（15 mg/kg）建立膿毒癥模型，對照組按同比例注射相應體積生理鹽水。LPS處理小鼠后觀察小鼠72 h存活率并繪制生存曲線。造模72 h脫臼處死各組小鼠，收集肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）、雙肺組織備用。

1.2.2HE染色觀察小鼠肺組織病理變化 取各組小鼠肺組織固定于4%多聚甲醛溶液24 h，常規脫水、透明、浸蠟、包埋、切片，HE染色，每只小鼠隨機選取3張切片，光鏡下觀察組織學變化。

1.2.3RT-PCR檢測各組小鼠肺組織IL-18 mRNA表達 將小鼠肺組織置于液氮中研磨為組織勻漿，Trizol法提取組織總RNA，分光光度計檢測濃度與純度，根據逆轉錄試劑說明書逆轉錄為cDNA，按照RT-PCR試劑說明書及預實驗確定的反應時間與溫度進行RT-PCR，反應條件：95℃預變性30 s，95℃變性7 s→60℃退火30 s→72℃15 s，40個循環。RT-PCR引物序列為IL-18 F：5'-CCTTCATTGCCACGTACAGG-3'，IL-18 R：5'-GGGCTTGATGATGTGCTCTG-3'；β-actin F：5'-ATCACCATTGGAATGAGCG-3'，β-actin R：5'-TTGAAGGTAGTTCGTGGAT-3'。以β-actin為內參，2-ΔΔCt分析IL-18基因表達。實驗單獨重復3次。

1.2.4免疫熒光組織化學染色檢測小鼠肺組織IL-18表達和定位 各組小鼠肺組織切片常規脫蠟水化后，采用檸檬酸緩沖液微波進行抗原修復，冷卻至室溫，PBS漂洗，加入5%BSA室溫孵育20 min進行封閉，滴加適當稀釋后的兔抗IL-18多克隆抗體（1∶200）4℃孵育過夜，次日37℃復溫，PBS漂洗，加入Alexa Fluor 647標記的山羊抗兔抗體（1∶800）室溫孵育30 min，PBS漂洗，加入5μg/ml DAPI染液室溫孵育30 min，PBS漂洗，加入防熒光淬滅劑，熒光顯微鏡觀察。

1.2.5TUNEL試劑盒檢測肺組織細胞凋亡 各組小鼠肺組織經4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，切片，脫蠟，水化，按TUNEL試劑盒說明書檢測肺組織細胞凋亡情況：各組小鼠肺組織切片中加入TUNEL反應液及DAPI染液37℃孵育1 h，PBS洗滌3次，加入防熒光淬滅劑封片，熒光顯微鏡觀察。細胞凋亡率為高倍視野下每100個細胞中TUNEL染色陽性細胞數。實驗單獨重復3次。

1.2.6肺單個核細胞中Th17與Treg水平檢測10%水合氯醛（0.004 ml/g）麻醉小鼠后仰臥位固定，外科剪打開胸腔，暴露心臟，2 ml注射器針頭從左心室插入，同時剪破右心房，以1 ml/5 s進行生理鹽水灌注，直至右心房流出清亮液體。取雙肺組織，生理鹽水漂洗，無菌外科剪將肺組織盡量剪碎，置于含0.5 g/LⅠ型膠原酶與DNaseⅠ的DMEM培養基中37℃水浴搖床消化90 min，200目濾網過濾2次，1 000 r/min離心5 min，取底層沉淀，DMEM重懸，輕輕置于40%與80%的Percoll不連續密度梯度液面，3 000 r/min離心20 min，取中層細胞，重懸于10 ml PBS，1 000 r/min離心5 min，洗滌2次，所得底層細胞沉淀即為肺單個核細胞，臺盼藍拒染法檢測細胞活力＞90%，調整細胞密度至2×106個/ml，流式細胞術檢測Th17與Treg占比：①Th17檢測：取約2×106個細胞接種于培養皿，含10%FBS的DMEM培養液培養，加入4μl PMA與離子霉素及BFA進行體外刺激，37℃、5%CO2恒溫恒濕培養5 h，培養終止后調整細胞至1×106個/ml，取100μl細胞懸液于流式管，加入2μl FITC-CD4，渦旋混勻，4℃避光孵育30 min，加入100 μl固定破膜液，4℃避光孵育15 min，3 ml PBS重懸細胞，1 000 r/min離心5 min，洗滌細胞，棄上清，渦旋分散底層細胞沉淀，加入100μl固定破膜液及5 μl PE-Cy5.5-IL-17A，混勻，4℃避光孵育30 min，PBS再次離心洗滌細胞，加入500μl流式染色緩沖液重懸細胞，上機檢測Th17（CD4+IL-17A+）比例；②Treg檢測：取1×106個細胞至流式管，PBS按上述方法離心洗滌并重懸，加入5 μl FITC-CD4與APC-CD25，4℃避光孵育40 min，PBS再次離心洗滌細胞，棄上清，渦旋分散細胞，每管加入1 ml固定破膜液，混勻，4℃避光孵育20 min，PBS離心洗滌細胞，加入5 μl PE-FoxP3，渦旋混勻，4℃避光孵育30 min，PBS離心洗滌細胞，加入500μl流式緩沖液上機檢測Treg比例（CD4+CD25+FoxP3+）。

1.2.7BALF抽取 小鼠處死后進行氣管插管，0.8 ml預冷生理鹽水灌洗雙肺，停留5～8 s并輕輕按摩雙肺組織，緩慢回抽BALF，重復3次。將收集的BALF于4℃、3 000 r/min離心20 min，收集上清，-20℃保存備用。

1.2.8ELISA檢測BALF中TNF-α、IL-17A、TGF-1β、IL-10表 達 按 照TNF-α、IL-17A、TGF-1β、IL-10 ELISA試劑盒說明檢測各組小鼠BALF中上述細胞因子表達。實驗單獨重復3次。

1.2.9Western blot檢測IL-18、STAT3、p-STAT3及RORγt和FoxP3蛋白水平 取各組小鼠肺組織置于液氮中研磨成粉狀，加入400 μl含蛋白酶抑制劑（PMSF）的RIPA裂 解 液 冰 上 消 化30 min，4℃、12 000 r/min離心10 min，上清即為肺組織總蛋白，BCA法進行蛋白定量，按1∶4向上清中加入5×蛋白上樣緩沖液，沸水加熱變性10 min。取50 μg蛋白進行SDS-PAGE電泳分離蛋白，濕轉至PVDF膜，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，分別加入IL-18（1∶500）、STAT3（1∶800）、p-STAT3（1∶800）、RORγt（1∶500）、FoxP3（1∶500）、β-actin（1∶2 000）一抗4℃搖床孵育過夜，TBST清洗3次，5 min/次，以HRP標記的二抗（1∶5 000）室溫孵育1 h，TBST清洗3次，5 min/次，均勻滴加ECL發光液后于凝膠成像儀曝光拍照，Image J軟件測定條帶灰度值，蛋白相對表達=目標蛋白灰度值/內參β-actin灰度值。實驗重復3次。

1.3統計學分析 采用SPSS19.0軟件進行統計學分析，計量資料以±s表示。采用單因素方差分析（one-way ANOVA）進行多組間分析，兩組間比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1IL-18缺陷對LPS誘導的膿毒癥肺損傷的影響 觀察各組小鼠72 h生存率，結果顯示，與WT組小鼠相比，WT LPS組與IL-18-/-LPS組小鼠存活率顯著降低（P＜0.05），IL-18-/-組小鼠無明顯變化（P＞0.05）；與WT LPS組相比，與IL-18-/-LPS組小鼠存活率顯著升高（P＜0.05，圖1）。各組小鼠肺組織HE染色結果顯示，WT組與IL-18-/-組小鼠肺泡結構完整，肺泡上皮細胞及肺泡間隔形態正常，泡腔清晰，無滲出，肺間質無出血、水腫及炎癥細胞浸潤，WT LPS組小鼠肺泡結構破壞，肺泡腔塌陷或融合，大小不等，肺泡間隔明顯增厚，肺間質可見充血、水腫、炎癥細胞浸潤；IL-18-/-LPS組小鼠肺損傷較WT LPS組小鼠減輕，僅少數肺泡結構破壞，肺間質滲出及炎癥細胞浸潤減少（圖2）。

圖1 各組小鼠生存曲線Fig.1 Survival curve of mice in each group

圖2 HE染色觀察各組小鼠肺組織損傷Fig.2 Lung tissue injury of mice in each group observed by HE staining

2.2各組小鼠肺組織IL-18表達及定位RT-PCR及Western blot檢測各組小鼠IL-18 mRNA及蛋白表達，結果顯示，與WT組相比，WT LPS組小鼠IL-18 mRNA及蛋白表達均顯著增加，而IL-18-/-組與IL-18-/-LPS組顯著降低（P＜0.01，圖3）；免疫熒光組織化學染色結果同樣表明，WT LPS組小鼠IL-18熒光強度較WT組小鼠顯著增強（P＜0.01），而IL-18-/-組與IL-18-/-LPS組小鼠無明顯IL-18熒光表達（圖4）。

圖3 各組小鼠肺組織IL-18 mRNA及蛋白表達Fig.3 mRNA and protein expressions of IL-18 in lung tissues of mice in each group

圖4 免疫熒光檢測各組小鼠肺組織IL-18表達（×200）Fig.4 Expression of IL-18 in lung tissues of mice in each group detected by immunofluorescence（×200）

2.3IL-18缺陷抑制LPS誘導的膿毒癥肺組織細胞凋亡TUNEL染色檢測各組小鼠肺組織細胞凋亡情況，結果顯示，與WT組相比，WT LPS組與IL-18-/-LPS組小鼠凋亡細胞顯著增加（P＜0.05），IL-18-/-組小鼠無明顯變化；而與WT LPS組相比，IL-18-/-LPS組小鼠凋亡細胞顯著減少（P＜0.05，圖5）。

圖5 TUNEL染色檢測各組小鼠肺組織細胞凋亡Fig.5 TUNEL staining to detect apoptotic cells in lung tissues of mice in each group

2.4IL-18缺陷對LPS誘導的膿毒癥肺組織Treg/Th17的影響 流式細胞術檢測各組小鼠肺組織單個核細胞Treg與Th17占CD4+T細胞比例的變化，結果顯示：與WT組相比，WT LPS組與IL-18-/-LPS組小鼠Treg與Th17占比均明顯升高（P＜0.05），但WT LPS組Treg/Th17明顯降低（P＜0.05），而IL-18-/-LPS組該比值顯著升高（P＜0.05）；與WT LPS組相比，IL-18-/-LPS組小鼠Treg占比及Treg/Th17均顯著提高（P＜0.05），Th17占比差異無統計學意義（P＞0.05，圖6、表1）。

表1 各組小鼠肺組織Treg、Th17占比及Treg/Th17變化（±s）Tab.1 Changes of Treg，Th17 percentages and Treg/Th17 in lung tissue of mice in each group（±s）

表1 各組小鼠肺組織Treg、Th17占比及Treg/Th17變化（±s）Tab.1 Changes of Treg，Th17 percentages and Treg/Th17 in lung tissue of mice in each group（±s）

Note：Compared with WT group，1）P＜0.05；compared with WT LPS group，2）P＜0.05.

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圖6 流式細胞術檢測各組小鼠Treg、Th17比例變化Fig.6 Treg and Th17 percentages changes of mice in each group detected by flow cytometry

2.5IL-18缺陷對LPS誘導的膿毒癥肺組織炎癥因子表達的影響ELISA檢測各組小鼠BALF中炎癥因子TNF-α、IL-17A、TGF-1β、IL-10表達，結果顯示，與WT組小鼠相比，WT LPS組與IL-18-/-LPS組小鼠BALF中促炎因子TNF-α、IL-17A、TGF-1β、IL-10表達均顯著升高（P＜0.05），IL-18-/-組小鼠無明顯變化；而與WT LPS組相比，IL-18-/-LPS組小鼠肺組織中抑炎因子TGF-1β、IL-10表達顯著增加（P＜0.05），而促炎因子TNF-α、IL-17A表達顯著減少（P＜0.05，表2）。

表2 各組細胞中炎癥因子TNF-α、IL-17A、TGF-1β、IL-10表達（±s，pg/ml）Tab.2 TNF-α，IL-17A，TGF-1β and IL-10 expressions of cells in each group（±s，pg/ml）

表2 各組細胞中炎癥因子TNF-α、IL-17A、TGF-1β、IL-10表達（±s，pg/ml）Tab.2 TNF-α，IL-17A，TGF-1β and IL-10 expressions of cells in each group（±s，pg/ml）

Note：Compared with WT group，1）P＜0.05；compared with WT LPS group，2）P＜0.05.

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2.6IL-18缺陷通過STAT3途徑改變LPS誘導的膿毒癥肺組織Treg與Th17占比Western blot結果顯示，與WT組小鼠相比，WT LPS組與IL-18-/-LPS組小鼠肺組織RORγt、FoxP3表達均降低，而p-STAT3表達顯著增加，IL-18-/-組小鼠無明顯變化；與WT LPS組小鼠相比，IL-18-/-LPS組小鼠肺組織FoxP3表達顯著增加，p-STAT3表達顯著降低，而RORγt、STAT3無明顯變化，IL-18-/-LPS組小鼠可能通過抑制STAT3磷酸化上調Treg比例（圖7）。

圖7 Western blot檢測各組小鼠肺組織FoxP3、RORγt及STAT3蛋白表達Fig.7 Western blot to detect protein expressions of FoxP3，RORγt and STAT3 in lung tissue of mice in each group

3 討論

ALI是膿毒癥最常見嚴重并發癥，重癥患者可發展為ARDS。盡管人們對膿毒癥介導的ALI研究眾多，但其發病率仍居高不下，病死率可達20%以上［2-3］。因此，積極探索膿毒癥導致ALI的相關機制，對疾病早期診斷、治療及預后評估具有重要臨床價值。既往研究證實，Th1/Th2亞群免疫失衡在膿毒癥相關ALI的免疫調節中發揮關鍵作用。嚴重創傷、感染等應激狀態下，機體Th1/Th2平衡被打破，引發異常免疫應答，導致機體對感染的清除能力下降［11-12］。盡管膿毒癥介導的ALI損傷機制與Th1/Th2免疫失衡有關，但針對該平衡所采取的干預措施效果卻無法令人滿意［13］。

Treg是20世紀發現的存在于機體CD4+T細胞中的一個重要亞群，在健康人群中占CD4+T細胞的5%～10%，其中FoxP3是人和動物體內Treg分化的特異性轉錄因子［14-16］。隨著對Treg功能研究深入，研究者發現Treg能夠通過表達TGF-β、IL-10等抑炎細胞因子參與免疫應答負性調節：如在腫瘤中，Treg能夠通過分泌相關細胞因子發揮免疫抑制作用從而促進腫瘤細胞免疫逃逸［17-18］；器官移植中，過繼回輸Treg能通過降低免疫排斥反應有效保護移植器官功能，延長其存活時間［19］。而Th17是T細胞的另一亞群，能夠在IL-6、IL-17A（或IL-17）、RORγt等細胞因子誘導下轉錄，并通過分泌IL-17A、IL-6及TNF-α等發揮促炎作用［20］。體內Treg/Th17失衡在多種疾病發生、發展過程中具有重要作用，如在幼年特發性關節炎中，Treg/Th17平衡向Th17偏移，導致患兒體內促炎因子IL-6、IL-1β表達增加，促進疾病進展［21］。炎癥性腸病中，姜黃素能夠通過IL-6/STAT3信號通路調控Treg/Th17平衡治療潰瘍性結腸炎［22］。提示Treg/Th17作為CD4+T細胞的重要組成，對機體免疫功能的正常維持同樣發揮不可忽視的作用。

IL-18作為一種重要的促炎因子，能夠被肝、腎、骨骼肌等器官及組織的多種細胞（如內皮細胞、單核細胞等）轉錄并表達，并在抗感染、免疫調節、抗腫瘤及慢性炎癥等疾病過程中發揮多項生物學功能［7］。同時，研究顯示IL-18作為炎癥級聯反應上游的重要促炎因子，能夠誘導TNF-α、IL-1β、IL-13等早期炎癥因子表達，其中TNF-α作為最主要的促炎因子，是內毒素損傷效應的關鍵遞質之一；其次，IL-18還能夠通過炎癥級聯反應進一步誘導下游多種趨化因子（如單核細胞趨化因子、巨噬細胞炎癥蛋白等）分泌，并促使其趨化至感染部位，進一步加劇炎癥反應［23］。已有研究提示IL-18可調節Treg/Th17平衡，如在陰道念珠菌病中，陰道液中IL-18低表達者更易感染念珠菌，可能與上調Treg表達從而導致Treg/Th17免疫失衡有關［10］；小鼠骨質疏松癥模型中也證實IL-18通過上調Th17表達，導致Treg/Th17失衡，從而促進破骨細胞生成，導致骨質流失［11］。不過關于IL-18在膿毒癥中影響Treg/Th17平衡的作用鮮有報道。

研究顯示，小鼠腹腔注射一定劑量（10～20 mg/kg）LPS，6～72 h內 能 較 好 地 動 態 展 示ALI演 變 規律［24-25］。為探究IL-18在ALI發生、發展中的作用，本研究通過敲除IL-18基因表達（IL-18-/-）小鼠腹腔注射15 mg/kg LPS誘導經典小鼠膿毒癥模型，發現WT LPS組小鼠72 h生存率較對照組顯著降低，且肺組織HE染色顯示肺組織結構損害嚴重，凋亡細胞顯著增加，而IL-18-/-組小鼠72 h內生存率、肺組織病理損傷及細胞凋亡均明顯改善。進一步研究發現，LPS誘導的ALI小鼠肺組織Treg和Th17占比及相關炎癥因子表達均較野生對照組小鼠明顯提高，而IL-18-/-LPS組小鼠肺組織Treg占比和Treg/Th17較WT LPS組小鼠顯著提高，Treg相關細胞因子TGF-1β、IL-10表達也明顯升高，而Th17占比無明顯改變，其相關細胞因子TNF-α、IL-17A表達均顯著減少。表明LPS誘導的ALI小鼠肺組織中呈過度炎癥反應，Treg相關負向免疫調控被抑制，而敲除IL-18基因后，促進Treg表達，小鼠體內Treg免疫應答抑制因IL-18敲除被部分抵消，體內過度炎癥反應被抑制。RORγt是Th17分化過程中特征性轉錄因子，其表達主要受STAT3調節，而STAT3磷酸化可促進RORγt轉錄及表達［26］。此外，STAT3同樣通過多種途徑削弱Treg的免疫抑制作用，并抑制其分化與增殖［27］。本研究采用Western blot檢測肺組織Treg與Th17重 要 轉 錄 因 子RORγt、FoxP3蛋 白 表 達 及STAT3磷酸化水平，結果顯示，IL-18-/-組小鼠FoxP3表達顯著增加，STAT3磷酸化水平明顯降低，而RORγt蛋白表達無明顯變化，提示敲除IL-18可能通過降低STAT3磷酸化水平促進FoxP3蛋白表達，從而上調Treg比例。

綜上，本研究發現IL-18基因缺失能通過降低STAT3磷酸化水平上調FoxP3表達，從而促進Treg及其相關炎癥因子表達，改善LPS導致的ALI。本研究補充了IL-18在膿毒癥作用中的具體作用及機制，有望為IL-18成為膿毒癥ALI治療過程的新靶點提供依據。