甘草己烷-乙醇提取物通過miR-151a-5p/GABARAPL1軸調(diào)控前列腺癌細(xì)胞增殖、凋亡①

孟慶榮 周振鵬 張 敏 王世平 孫秀斌 徐光玉

（山東第一醫(yī)科大學(xué)附屬濟(jì)南人民醫(yī)院泌尿外科，濟(jì)南 271199）

前列腺癌是男性常見惡性腫瘤，研究表明多種 中藥提取成分具有抑制前列腺癌細(xì)胞生長的作用，開發(fā)有效抑制前列腺癌細(xì)胞生長的中藥對其治療具有重要意義［1-2］。甘草是臨床常用中藥材，其提取物活性成分具有抗癌作用。研究報(bào)道，甘草己烷-乙醇提取物（hexane-ethanol extract of glycyrrhiza uralensis，HEGU）可抑制前列腺癌細(xì)胞遷移及乳腺癌細(xì)胞肺轉(zhuǎn)移［3-4］。甘草提取物還可誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞凋亡［5］。但HEGU對前列腺癌增殖、凋亡的影響及機(jī)制尚不清楚。研究發(fā)現(xiàn)，miRNA可影響前列腺癌惡性生物學(xué)行為［6］。前列腺癌組織中miR-151a-5p表達(dá)上調(diào)［7］。抑制miR-151a-5p表達(dá)可抑制肺癌A549細(xì)胞增殖、侵襲和遷移，促進(jìn)凋亡［8］。研究報(bào)道，GABA A型受體相關(guān)蛋白樣1（GABA type A receptor associated protein like 1，GABARAPL1）在前列腺癌組織中下調(diào)，過表達(dá)GABARAPL1可降低細(xì)胞侵襲性［9］。本研究通過在線軟件預(yù)測發(fā)現(xiàn)，miR-151a-5p與GABARAPL1存在結(jié)合位點(diǎn)，但miR-151a-5p是否靶向調(diào)控GABARAPL1尚未可知。因此，本研究旨在探究HEGU是否通過miR-151a-5p/GABARAPL1影響前列腺癌增殖、凋亡。

1 材料與方法

1.1材料 甘草購自山東天一飲片廠，產(chǎn)地內(nèi)蒙古，經(jīng)山環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）法鑒定為豆科植物甘草（glycyrrhiza uralensis fisch）的干燥根；人前列腺癌細(xì)胞PC-3（貨號：YS1994C，上海雅吉生物科技有限公司）；RPMI1640培養(yǎng)基（貨號：GNM-31800，上海經(jīng)科化學(xué)科技有限公司）；MTT試劑盒（貨號：M1020，江西江藍(lán)純生物試劑有限公司）；凋亡檢測試劑盒（貨號：KA3805，艾美捷科技有限公司）；蛋白提取試劑盒（貨號：CD-13559-ML，武漢純度生物科技有限公司）；超敏ECL化學(xué)發(fā)光液（貨號：XYM2301，上海信裕生物科技有限公司）；CyclinD1抗體（貨號：PL0502539，加拿大PLLABS公司）；p21抗體（貨號：252156）、Bcl-2抗體（貨號：253037）、Bax抗體（貨號：251834，美國Abbiotec公司）；GAPDH抗體（貨號：AF7021，美國Affinity公司）；IgG-HRP二抗（貨號：ASE134，上海吉至生化科技有限公司）；Trizol試劑（貨號：GMS12279，上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司）；SYBR Premix ExTaq試劑盒（貨號：DRR041A，北京智杰方遠(yuǎn)科技有限公司）；雙熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒（貨號：KGAF040，江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司）。

1.2方法

1.2.1HEGU制備 參考文獻(xiàn)［3］提取甘草：取100 g甘草干燥根，粉碎，室溫下用己烷-乙醇（9∶1）溶液浸泡24 h，過濾除渣，萃取2次，過濾并合并2次提取液，減壓濃縮濾液，即得到HEGU。

1.2.2細(xì)胞處理與分組 采用RPMI1640培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)PC-3細(xì)胞，取對數(shù)生長期細(xì)胞，分別用2、4、8μg/ml HEGU處理作為不同劑量HEGU組；不做處理的細(xì)胞作為NC組；將anti-con、anti-miR-151a-5p、miR-con、miR-151a-5p轉(zhuǎn)染至PC-3細(xì)胞，作為anticon組、anti-miR-151a-5p組、miR-con組、miR-151a-5p組；將miR-con、miR-151a-5p轉(zhuǎn) 染 至PC-3細(xì) 胞 后用8 μg/ml HEGU處 理，作 為HEGU+miR-con組、HEGU+miR-151a-5p組。

1.2.3MTT檢測細(xì)胞增殖 采用2、4、8 μg/ml HEGU處理PC-3細(xì)胞24 h，更換新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h、48 h、72 h，然后按照20μl/孔加入MTT溶液（5 mg/ml），孵育4 h，加入150 μl DMSO振蕩反應(yīng)10 min使沉淀溶解，酶標(biāo)儀檢測450 nm處吸光度（A450）。8μg/ml HEGU作用前列腺癌細(xì)胞0 h、6 h、12 h、24 h后，再培養(yǎng)24 h、48 h、72 h后按上述方法檢測細(xì)胞活性。

1.2.4流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 收集1.2.2中各組培養(yǎng)24 h細(xì)胞，預(yù)冷PBS漂洗2次，與500μl結(jié)合緩沖液混勻，加入10 μl AnnexinⅤ-FITC和5 μl PI混勻，避光孵育10 min，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。8 μg/ml HEGU作用前列腺癌細(xì)胞0 h、6 h、12 h、24 h后，分別再培養(yǎng)24 h后按上述方法檢測細(xì)胞凋亡率。

1.2.5Western blot檢測蛋白表達(dá) 提取各組培養(yǎng)24 h細(xì)胞總蛋白，蛋白定量后煮沸變性，進(jìn)行SDSPAGE，轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂牛奶封閉1 h，加入一抗4℃孵育過夜，加入二抗室溫孵育2 h，加入ECL液顯影，Quantity One分析蛋白條帶灰度值，蛋白相對表達(dá)=目的條帶相對表達(dá)/內(nèi)參GAPDH條帶相對表達(dá)。

1.2.6RT-qPCR檢 測miR-151a-5p和GABARAPL1 mRNA表達(dá) 提取各組培養(yǎng)24 h細(xì)胞總RNA，合成cDNA，按照試劑盒說明操作，PCR反應(yīng)體系：2μl反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物、10 μl SYBR Green Mix、正反向引物各0.5 μl、7 μl無菌水；循環(huán)條件為95℃2 min，95℃15 s，60℃30 s，72℃30 s，共40個循環(huán)；熔解曲線：95℃15 s，60℃15 s，95℃15 s。2-ΔΔCt計(jì)算相對表達(dá)。miR-151a-5p和GABARAPL1分 別 以U6和GAPDH為內(nèi)參，miR-151a-5p正向引物：5'-GCGGCGGTCGAGGAGCTCACAG-3'，反向引物：5'-ATCCAGTGCAGGGTCCGAGG-3'；U6正向引物：5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，反向引物：5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'；GABARAPL1正向引物：5'-ATCCGGAAGAGAATCCACCT-3'，反向引物：5'-GCTAGAGGATGCCAGACTGC-3'；GAPDH正向引物：5'-TGTTGCCATCAATCACCCCTT-3'，反向引物：5'-CTCCACGACGTACTCAGCG-3'。

1.2.7雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)檢測miR-151a-5p和GABARAPL1的靶向關(guān)系 構(gòu)建GABARAPL1野生型和突變型雙熒光素酶載體WT-GABARAPL1和MUT-GABARAPL1，分別與miR-NC和miR-151a-5p共轉(zhuǎn)染至PC-3細(xì)胞，按說明書檢測熒光素酶活性。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料用±s表示，兩兩比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，P＜

0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1不同劑量HEGU對前列腺癌細(xì)胞增殖、凋亡的影響 與NC組比較，不同劑量HEGU作用后，前列腺癌細(xì)胞活性降低，凋亡率升高，CyclinD1、Bcl-2表達(dá)降低，p21、Bax表達(dá)升高，且呈劑量依賴性（P＜0.05，表1、圖1）。8μg/ml HEGU作用前列腺癌細(xì)胞后，與0 h相比，作用6 h、12 h、24 h后前列腺癌細(xì)胞活性降低，凋亡率升高，CyclinD1、Bcl-2表達(dá)降低，p21、Bax表達(dá)升高，且呈時(shí)間依賴性（P＜0.05，表2、圖2）。

圖2 8 μg/ml HEGU不同作用時(shí)間對前列腺癌細(xì)胞增殖、凋亡的影響Fig.2 Effects of 8 μg/ml HEGU on proliferation and apoptosis of prostate cancer cells at different times

表1 不同劑量HEGU對前列腺癌細(xì)胞增殖、凋亡、相關(guān)蛋白表達(dá)的影響（±s，n=5）Tab.1 Effects of different doses of HEGU on proliferation，apoptosis and related protein expressions of prostate cancer cells（±s，n=5）

表1 不同劑量HEGU對前列腺癌細(xì)胞增殖、凋亡、相關(guān)蛋白表達(dá)的影響（±s，n=5）Tab.1 Effects of different doses of HEGU on proliferation，apoptosis and related protein expressions of prostate cancer cells（±s，n=5）

Note：Compared with NC group，1）P＜0.05；compared with 2μg/ml group，2）P＜0.05；compared with 4μg/ml group，3）P＜0.05.

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表2 8 μg/ml HEGU不同作用時(shí)間對前列腺癌細(xì)胞增殖、凋亡及相關(guān)蛋白表達(dá)的影響（±s，n=5）Tab.2 Effects of 8 μg/ml HEGU on proliferation，apoptosis and related protein expressions of prostate cancer cells（±s，n=5）

表2 8 μg/ml HEGU不同作用時(shí)間對前列腺癌細(xì)胞增殖、凋亡及相關(guān)蛋白表達(dá)的影響（±s，n=5）Tab.2 Effects of 8 μg/ml HEGU on proliferation，apoptosis and related protein expressions of prostate cancer cells（±s，n=5）

Note：Compared with 0 h group，1）P＜0.05；compared with 6 h group，2）P＜0.05；compared with 12 h group，3）P＜0.05.

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圖1 不同劑量HEGU對前列腺癌細(xì)胞增殖、凋亡的影響Fig.1 Effect of different doses of HEGU on proliferation and apoptosis of prostate cancer cells

2.2不同劑量HEGU作用于前列腺癌細(xì)胞后對miR-151a-5p和GABARAPL1 mRNA表 達(dá)的影 響與NC組比較，不同劑量HEGU作用后，前列腺癌細(xì)胞miR-151a-5p表達(dá)降低，GABARAPL1 mRNA表達(dá)升高，且呈劑量依賴性（P＜0.05，表3）。

表3 不同劑量HEGU作用于前列腺癌細(xì)胞后對miR-151a-5p和GABARAPL1 mRNA表達(dá)的影響（±s，n=5）Tab.3 Effects of different doses of HEGU on expressions of miR-151a-5p and GABARAPL1 mRNA in prostate cancer cells（±s，n=5）

表3 不同劑量HEGU作用于前列腺癌細(xì)胞后對miR-151a-5p和GABARAPL1 mRNA表達(dá)的影響（±s，n=5）Tab.3 Effects of different doses of HEGU on expressions of miR-151a-5p and GABARAPL1 mRNA in prostate cancer cells（±s，n=5）

Note：Compared with NC group，1）P＜0.05；compared with 2 μg/ml group，2）P＜0.05；compared with 4μg/ml group，3）P＜0.05.

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2.3anti-miR-151a-5p轉(zhuǎn)染對前列腺癌細(xì)胞增殖、凋亡的影響 與anti-con組比較，anti-miR-151a-5p組miR-151a-5p表達(dá)、細(xì)胞活性降低，凋亡率升高，CyclinD1、Bcl-2表達(dá)降低，p21、Bax表達(dá)升高（P＜0.05，表4、圖3）。

表4 anti-miR-151a-5p轉(zhuǎn)染對前列腺癌細(xì)胞增殖、凋亡及相關(guān)蛋白表達(dá)的影響（±s，n=5）Tab.4 Effect of anti-miR-151a-5p transfection on proliferation，apoptosis and related protein expressions of prostate cancer cells（±s，n=5）

表4 anti-miR-151a-5p轉(zhuǎn)染對前列腺癌細(xì)胞增殖、凋亡及相關(guān)蛋白表達(dá)的影響（±s，n=5）Tab.4 Effect of anti-miR-151a-5p transfection on proliferation，apoptosis and related protein expressions of prostate cancer cells（±s，n=5）

Note：Compared with anti-con group，1）P＜0.05.

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圖3 anti-miR-151a-5p對前列腺癌細(xì)胞增殖、凋亡的影響Fig.3 Effect of anti-miR-151a-5p on proliferation and apoptosis of prostate cancer cells

2.4miR-151a-5p與GABARAPL1直接相互作用miR-151a-5p和GABARAPL1存在互補(bǔ)核苷酸序列（圖4）。miR-151a-5p與WT-GABARAPL1共轉(zhuǎn)染的細(xì)胞熒光素酶活性低于miR-con與WT-GABARAPL1共轉(zhuǎn)染的細(xì)胞（P＜0.05）；而WT-GABARAPL1與miR-151a-5p或miR-con共轉(zhuǎn)染的細(xì)胞熒光素酶活性無明顯變化（P＞0.05，表5）。

表5 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)（±s，n=5）Tab.5 Double luciferase report experiment（±s，n=5）

表5 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)（±s，n=5）Tab.5 Double luciferase report experiment（±s，n=5）

Note：Compared with miR-con group，1）P＜0.05.

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圖4 miR-151a-5p和GABARAPL1存在互補(bǔ)核苷酸序列Fig.4 miR-151a-5p and GABARAPL1 have complementary nucleotide sequences

2.5miR-151a-5p調(diào)控前列腺癌細(xì)胞系中GABARAPL1表達(dá) 與miR-con組比較，miR-151a-5p組miR-151a-5p表達(dá)升高，GABARAPL mRNA表達(dá)降低（P＜0.05）；與anti-miR-con組比較，anti-miR-151a-5p組miR-151a-5p表達(dá)降低，GABARAPL mRNA表達(dá)升高（P＜0.05，表6）。

表6 轉(zhuǎn)染miR-151a-5p mimic和anti-miR-151a-5p對前列腺癌細(xì)胞GABARAPL1 mRNA表達(dá)的影響（±s，n=5）Tab.6 Effect of transfection of miR-151a-5p mimic and anti-miR-151a-5p on GABARAPL1 mRNA expression in prostate cancer cells（±s，n=5）

表6 轉(zhuǎn)染miR-151a-5p mimic和anti-miR-151a-5p對前列腺癌細(xì)胞GABARAPL1 mRNA表達(dá)的影響（±s，n=5）Tab.6 Effect of transfection of miR-151a-5p mimic and anti-miR-151a-5p on GABARAPL1 mRNA expression in prostate cancer cells（±s，n=5）

Note：Compared with miR-con group，1）P＜0.05；compared with antimiR-con group，2）P＜0.05.

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2.6過表達(dá)miR-151a-5p逆轉(zhuǎn)HEGU（8 μg/ml）對前列腺癌細(xì)胞增殖、凋亡的影響 與miR-con組比較，miR-151a-5p組GABARAPL1 mRNA表達(dá)降低，miR-151a-5p表達(dá)升高，細(xì)胞活性升高，凋亡率降低，CyclinD1、Bcl-2表達(dá)升高，p21、Bax表達(dá)降低（P＜0.05）；與HEGU+miR-con組比較，HEGU+miR-151a-5p組GABARAPL1 mRNA表達(dá)降低，miR-151a-5p表達(dá)升高，細(xì)胞活性升高，凋亡率降低，CyclinD1、Bcl-2表達(dá)升高，p21、Bax表達(dá)降低（P＜0.05，表7、圖5）。

表7 過表達(dá)miR-151a-5p逆轉(zhuǎn)HEGU（8 μg/ml）對前列腺癌細(xì)胞增殖、凋亡、相關(guān)蛋白表達(dá)的影響（±s，n=5）Tab.7 Overexpression of miR-151a-5p reverses effects of HEGU（8 μg/ml）on proliferation，apoptosis and related protein expressions of prostate cancer cells（±s，n=5）

表7 過表達(dá)miR-151a-5p逆轉(zhuǎn)HEGU（8 μg/ml）對前列腺癌細(xì)胞增殖、凋亡、相關(guān)蛋白表達(dá)的影響（±s，n=5）Tab.7 Overexpression of miR-151a-5p reverses effects of HEGU（8 μg/ml）on proliferation，apoptosis and related protein expressions of prostate cancer cells（±s，n=5）

Note：Compared with miR-con group，1）P＜0.05；compared with HEGU+miR-con group，2）P＜0.05.

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圖5 過表達(dá)miR-151a-5p逆轉(zhuǎn)HEGU（8 μg/ml）對前列腺癌細(xì)胞增殖、凋亡的影響Fig.5 Overexpression of miR-151a-5p reverses effect of HEGU（8 μg/ml）on proliferation and apoptosis of prostate cancer cells

3 討論

研究顯示，中醫(yī)藥輔助治療前列腺癌不僅能提高臨床療效，還能減輕不良反應(yīng)，提高患者生活質(zhì)量［10］。因此，開發(fā)抗前列腺癌的中藥有助于前列腺癌治療。研究報(bào)道，甘草提取物Gc34可抑制肝癌細(xì)胞侵襲、增殖，抑制胃癌細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，說明甘草提取物對不同腫瘤均有抑制作用［11-12］。為研究甘草提取物是否對前列腺癌細(xì)胞具有抑制作用，本研究采用2、4、8μg/ml HEGU處理前列腺癌細(xì)胞PC-3，結(jié)果顯示，細(xì)胞活性降低，凋亡率升高，CyclinD1、Bcl-2表達(dá)降低，p21、Bax表達(dá)升高，且呈劑量依賴性，表明HEGU可劑量依賴性抑制前列腺癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

研究報(bào)道，miR-151a-5p在大腸癌中顯著過表達(dá)，可作為大腸癌診斷的潛在生物標(biāo)志物［13］。下調(diào)miR-151a-5p表達(dá)能抑制A549細(xì)胞增殖、遷移及侵襲［14］。已有研究報(bào)道，miR-151a-5p在前列腺癌組織中表達(dá)上調(diào)，但miR-151a-5p對前列腺癌細(xì)胞增殖、凋亡的影響尚不清楚。為研究miR-151a-5p對前列腺癌細(xì)胞增殖、凋亡的影響，本研究將miR-151a-5p表達(dá)抑制載體轉(zhuǎn)染至PC-3細(xì)胞，結(jié)果顯示，細(xì)胞活性降低，凋亡率升高，CyclinD1、Bcl-2表達(dá)降低，p21、Bax表達(dá)升高，表明抑制miR-151a-5p表達(dá)可抑制前列腺癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，且HEGU處理的前列腺癌細(xì)胞PC-3中miR-151a-5p表達(dá)降低，提示HEGU可能調(diào)控miR-151a-5p表達(dá)。為闡明miR-151a-5p是否影響HEGU對前列腺癌細(xì)胞增殖、凋亡的影響，本研究過表達(dá)miR-151a-5p后采用HEGU處理前列腺癌細(xì)胞PC-3，結(jié)果顯示，過表達(dá)miR-151a-5p逆轉(zhuǎn)了HEGU對前列腺癌細(xì)胞增殖、凋亡的影響。提示HEGU可能通過調(diào)控miR-151a-5p影響前列腺癌細(xì)胞增殖、凋亡。

研究報(bào)道，GABARAPL1低表達(dá)與肝細(xì)胞癌患者不良預(yù)后相關(guān)［15］。抑制GABARAPL1表達(dá)可抑制三陰性乳腺癌細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［16］。miR-143通過靶向GABARAPL1抑制胃癌細(xì)胞自噬提高槲皮素功效［17］。白藜蘆醇可通過下調(diào)GABARAPL1表達(dá)抑制乳腺癌BT474細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡［18］。本研究通過在線軟件預(yù)測發(fā)現(xiàn)，miR-151a-5p與GABARAPL1存在結(jié)合位點(diǎn)，雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)證實(shí)了miR-151a-5p可靶向調(diào)控GABARAPL1表達(dá)；此外，分別檢測了過表達(dá)miR-151a-5p和抑制miR-151a-5p表達(dá)后GABARAPL1表達(dá)，發(fā)現(xiàn)miR-151a-5p可負(fù)調(diào)控GABARAPL1表達(dá)。本研究進(jìn)一步檢測了HEGU處理前列腺癌細(xì)胞PC-3后GABARAPL1表達(dá)，發(fā)現(xiàn)GABARAPL1呈高表達(dá)。提示HEGU可調(diào)控前列腺癌細(xì)胞GABARAPL1表達(dá)。

綜上，HEGU可能通過調(diào)控miR-151a-5p/GABARAPL1軸抑制前列腺癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。但本研究僅在體外細(xì)胞中進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)，其是否在體內(nèi)起作用有待進(jìn)一步研究，今后將進(jìn)一步通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。本研究為HEGU臨床用于前列腺癌防治提供了理論依據(jù)。