芍藥苷通過抑制NLRP3炎癥小體活化減輕病毒性心肌炎小鼠心肌損傷

陳家顯 陳 磊 張遠生 劉先霞 陳勁松（海南醫學院第二附屬醫院心血管內科，海口 570311）

病毒性心肌炎（viral myocarditis，VMC）是由嗜心性病毒引發的心肌局限或彌漫性炎癥性病變，是一種復雜的兒童獲得性心血管系統疾病，近年來發病率呈明顯上升趨勢［1］。目前VMC的發病機制尚未完全明確，但有研究顯示，VMC的發生、發展過程與病毒感染后機體炎癥通路激活密切相關［2］。NOD樣受體蛋白3（NOD-like receptor protein 3，NLRP3）炎癥小體是免疫反應的重要組成部分，與心血管疾病關系密切。眾多研究已證實，NLRP3炎癥小體的激活參與心肌病和心律失常等疾病的發生發展過程，提示NLRP3炎癥通路可能成為VMC治療的新靶點［3-4］。目前VMC的臨床治療以輔助支持療法和抗病毒治療為主，但效果并不理想，因此急需尋找能有效抑制VMC的藥物。隨著現代藥物提取工藝和科學技術的飛躍發展，中藥相關單體在抗病毒、防止心臟重構、免疫調節方面取得較大成就［5］。芍藥苷（paeoniflorin，PF）是傳統中藥芍藥的主要活性成分，具有抗炎、抗氧化、免疫調節等功能［6］。既往研究表明，PF具有減輕心肌肥厚、抑制心肌纖維化、減少心肌炎癥反應、改善左室功能、促進心室重構等作用，但目前關于PF在VMC中作用的研究甚少［7-8］。本研究擬采用柯薩奇B3（coxsackievirus B3，CVB3）病毒感染構建VMC小鼠模型，研究PF對VMC的保護作用，并探討其可能作用機制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物60只SPF級雄性BALB/c小鼠，6～7周齡，體質量18～22 g，由湖南省實驗動物中心提供，動物合格證編號：SCXK（湘）2016-0002。

1.1.2主要試劑與儀器PF（純度≥98%，批號：190301）購自成都曼思特生物科技有限公司；CVB3嗜心肌Nancy標準株購自美國標準菌種保存中心（ATCC）；單鈉尿酸鹽（monosodium urate，MSU）購自法國InvivoGen公司；TUNEL染色試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒購自上海碧云天生物公司；Cleaved caspase-3、NLRP3、凋亡相關斑點樣蛋白（ASC）、半胱天冬酶-1（caspase-1）和GAPDH抗體購自美國Cell Signaling Technology公司；HE染色試劑盒購自北京索萊寶公司；心肌肌鈣蛋白Ⅰ（cTnⅠ）、肌酸激酶同工酶（CK-MB）、肌紅蛋白（Mb）購自上海索萊寶生物科技有限公司；IL-1β、IL-18和TNF-α ELISA檢測試劑盒購自美國R＆D公司。

1.2方法

1.2.1動物造模及分組處理60只BALB/c小鼠隨機分成空白對照組（blank）、VMC模型組（VMC）、PF低劑量組（PF-L，10 mg/kg）、PF高劑量組（PF-H，40 mg/kg）和高劑量PF聯合NLRP3激動劑組（PF-H+MSU，40 mg/kg PF+5 mg/kg MSU），每組12只。采用腹腔注射0.1 ml 100 TCID50的CVB3病毒溶液建立病毒性心肌炎小鼠模型［9］，次日開始腹腔注射給藥，給藥體積為0.25 ml，對照組和模型組注射等量生理鹽水，1次/d，連續給藥7 d。7 d后眼球取血，分離血清后儲存于-80℃冰箱待檢。采血后頸椎脫臼法處死小鼠，留取心臟組織，取部分組織置于4%多聚甲醛固定，其余組織置于液氮中保存。

1.2.2HE染色觀察心肌損傷情況 收集各組小鼠心肌組織，經生理鹽水洗凈后用4%多聚甲醛固定，經包埋后行石蠟切片，HE染色后光鏡下觀察心臟組織炎癥細胞浸潤情況。

1.2.3TUNEL染色觀察心肌組織細胞凋亡情況

收集各組小鼠心肌組織，包埋后進行石蠟切片，常規脫蠟，PBS漂洗，加蛋白酶K室溫下水解20 min，加蒸餾水洗，3%過氧化氫室溫下反應5 min，PBS漂洗3次。加TUNEL反應液，于37℃濕盒中避光孵育60 min，PBS漂洗3次，加過氧化物酶標記的抗體，濕盒中室溫孵育30 min，PBS漂洗3次，加顯色液，室溫反應5 min。蒸餾水洗，脫水，透明，中性樹膠封片。光學顯微鏡下觀察并拍照，隨機選取5個視野，心肌細胞凋亡率（%）=凋亡心肌細胞數/心肌細胞總數×100%。

1.2.4ELISA法檢測心肌損傷標志物及炎癥因子 收集各組小鼠血清和心肌組織，心肌組織勻漿離心后收集上清液，按照試劑盒說明書進行操作，采用酶標儀在450 nm波長處測定各孔的OD值，根據標準曲線計算血清中心肌損傷標志物cTnⅠ、CKMB、Mb及心肌組織中IL-1β、IL-18和TNF-α含量。1.2.5Western blot檢測蛋白表達 取適量心肌組織，加入RIPA裂解液充分研磨勻漿至液體狀態，12 000 r/min離心25 min，收集上清液，BCA法測定上清液中總蛋白含量。取等量蛋白進行SDS-PAGE凝膠電泳分離并轉至PVDF膜，5%的脫脂牛奶封閉2 h，加入相應的一抗抗體稀釋液（Cleaved caspase-3、NLRP3、ASC、caspase-1、GAPDH，1∶1 000），4℃過夜孵育，次日加入HRP標記的二抗，室溫孵育1 h。最后加入發光液于凝膠成像儀進行曝光拍照，利用Image J圖像分析軟件進行分析，以目的條帶與GAPDH的灰度值比值，作為目的蛋白表達的相對水平。

1.3統計學分析 通過SPSS22.0軟件進行處理，結果以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，事后兩兩組內比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1PF對VMC小鼠體質量及狀態的影響 如表1所示，blank組、VMC組、PF-L組、PF-H組和PF-H+MSU組小鼠在飼養1 d、3 d、5 d、7 d期間體質量均呈逐漸上升的趨勢，但在5 d、7 d時VMC組、PF-L組和PF-H+MSU組小鼠體質量顯著低于blank組，同時出現皮毛無光澤、活動減少、蜷縮駝背等委頓癥狀。

表1 各組小鼠體質量比較（±s，n=12，g）Tab.1 Comparison of body weight of mice in each group（±s，n=12，g）

表1 各組小鼠體質量比較（±s，n=12，g）Tab.1 Comparison of body weight of mice in each group（±s，n=12，g）

Note：-1 d.The day before inoculation of the virus；0 d.The day of virus inoculation.1）P＜0.01 vs blank group.

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2.2PF對VMC小鼠心肌組織損傷的影響 如圖1所示，blank組小鼠心肌細胞結構正常，排列規則，未見炎癥細胞浸潤；VMC組、PF-L組和PF-H+MSU組小鼠心肌細胞結構破壞嚴重，細胞排列紊亂，伴隨大量炎癥細胞浸潤；PF-H小鼠心肌細胞結構基本完整，細胞排列大致有序，有少量炎癥細胞浸潤。

圖1 各組小鼠心肌組織病理學觀察（HE染色，×200）Fig.1 Histopathological observation of myocardium of mice in each group（HE staining，×200）

2.3PF對VMC小鼠血清中心肌損傷標志物含量的影響 如圖2所示，與blank組比較，VMC組小鼠血清中cTnⅠ、CK-MB和Mb含量顯著增加（P＜0.01）；與VMC組比較，PF-H組小鼠血清中cTnⅠ、CK-MB和Mb含量顯著減少（P＜0.01），PF-L組無顯著變化（P＞0.05）；與PF-H組比較，PF-H+MSU組小鼠血清中cTnⅠ、CK-MB和Mb含量顯著增加（P＜0.01）。

圖2 各組小鼠血清中cTnⅠ、CK-MB和Mb含量比較Fig.2 Comparison of contents of cTnⅠ，CK-MB and Mb in serum of mice in each group

2.4PF對VMC小鼠心肌組織中炎癥因子含量的影響 如圖3所示，與blank組比較，VMC組小鼠心肌組織中IL-1β、IL-18和TNF-α含量顯著增加（P＜0.01）；與VMC組比較，PF-H組小鼠心肌組織中IL-1β、IL-18和TNF-α含量顯著減少（P＜0.01），PF-L組無顯著變化（P＞0.05）；與PF-H組比較，PF-H+MSU組小鼠心肌組織中IL-1β、IL-18和TNF-α含量顯著增加（P＜0.01）。

圖3 各組小鼠心肌組織中IL-1β、IL-18和TNF-α含量比較Fig.3 Comparison of contents of IL-1β，IL-18 and TNF-α in myocardium of mice in each group

2.5PF對VMC小鼠心肌組織細胞凋亡的影響

如圖4所示，與blank組比較，VMC組小鼠心肌組織細胞凋亡率顯著提高（P＜0.01），心肌組織中Cleaved caspase-3蛋白表達水平顯著上升（P＜0.01）；與VMC組比較，PF-H組小鼠心肌組織細胞凋亡率顯著降低（P＜0.01），心肌組織中Cleaved caspase-3蛋白表達水平顯著下降（P＜0.01），PF-L組

圖4 各組小鼠的心肌組織細胞凋亡情況比較Fig.4 Comparison of apoptosis of myocardial tissue cells of mice in each group

無顯著變化（P＞0.05）；與PF-H組比較，PF-H+MSU組小鼠心肌組織細胞凋亡率顯著增加（P＜0.01），心肌組織中Cleaved caspase-3蛋白表達水平顯著上升（P＜0.01）。

2.6PF對VMC小 鼠 心 肌組 織中NLRP3、ASC和caspase-1蛋白表達水平的影響 如圖5所示，與blank組比較，VMC組小鼠心肌組織中NLRP3、ASC和caspase-1蛋白表達水平顯著升高（P＜0.01）；與VMC組比較，PF-H組小鼠心肌組織中NLRP3、ASC和caspase-1蛋白表達水平顯著降低（P＜0.01），PF-L組無顯著變化（P＞0.05）；與PF-H組比較，PF-H+MSU組小鼠心肌組織中NLRP3、ASC和caspase-1蛋白表達水平顯著升高（P＜0.01）。

圖5 各組小鼠心肌組織中NLRP3、ASC和caspase-1蛋白表達水平比較Fig.5 Comparison of protein expression levels of NLRP3，ASC and caspase-1 in myocardium of mice in each group

3 討論

VMC的發病機制十分復雜，多認為與病毒直接損傷心肌組織以及機體自身不恰當的免疫反應相關，越來越多的研究表明，NLRP3炎癥小體參與了VMC的發病過程：魏傲等［10］研究發現，VMC患者外周血中NLRP3、caspase-1、IL-1β和IL-18表達水平顯著升高，推斷VMC的發生可能與NLRP3炎癥小體的活化有關；WANG等［11］研究進一步發現，抑制NLRP3炎癥小體激活能減輕VMC模型小鼠心肌炎癥損傷，有效改善VMC模型小鼠心功能。提示NLRP3炎癥小體可能是VMC過程中一個極其重要的炎癥致病通路，也是一個可能潛在治療靶點。近些年天然產物在改善心肌損傷及減輕氧化應激和炎癥反應方面的積極作用被越來越多的學者關注，PF是中國傳統中藥芍藥中的主要活性成分，現已廣泛應用于治療心腦血管疾病，但PF在VMC中是否具有治療效果目前還未見報道。本研究結果顯示，PF能夠顯著減少VMC小鼠心肌組織內炎癥細胞浸潤，下調血清及心肌組織炎癥因子含量，從而抑制心肌組織細胞凋亡，其作用機制可能是通過抑制NLRP3炎癥小體通路的激活來實現的。

局限性和彌散性的心肌組織壞死、炎癥細胞浸潤是VMC過程中典型的病理變化，本研究中HE染色結果顯示，VMC模型小鼠心肌組織結構破壞，伴有大量炎癥細胞浸潤，與既往研究一致，提示CVB3誘導的VMC小鼠模型構建成功［12］。給予高劑量PF治療后，小鼠心肌組織病理損傷明顯減輕，心肌細胞排列趨于規則，炎癥細胞浸潤明顯減少。cTnⅠ、CK-MB和Mb為心肌損傷特異性標志物［13］，正常情況下cTnⅠ以復合物或游離狀態存在于心肌細胞中，當心肌細胞受損時，cTnⅠ會被釋放到血液中，使其在血液中的含量異常升高；CK-MB是心肌中重要的能量調節酶，VMC發生時快速進入血液，其在血液中的含量能特異地反映心肌受損程度；Mb具有貯存和運輸氧的功能，心肌損傷時血液中的Mb會迅速升高，眾多研究顯示，VMC過程中cTnⅠ、CKMB和Mb含量會明顯上升［14-15］。本研究結果顯示，與正常對照組比較，VMC模型小鼠血清中cTnⅠ、CK-MB和Mb含量顯著升高，高劑量PF治療能顯著降低其水平，說明PF能有效緩解CVB3造成的心肌損傷。

病毒感染造成心肌細胞死亡是導致心肌炎患者心臟功能減退的主要原因，當病毒侵襲心肌細胞時，機體一方面可激活凋亡程序，通過犧牲感染細胞達到清除病毒的作用；另一方面，病毒也可調控凋亡相關基因的表達，調控心肌細胞的凋亡［16］。本研究中TUNEL檢測結果顯示，與正常組對照比較，VMC模型小鼠心肌細胞凋亡率明顯增高，心肌組織中Cleaved caspase-3蛋白表達水平顯著上調，與LI等［17］研究發現一致，而高劑量PF治療組心肌細胞凋亡率和Cleaved caspase-3蛋白表達水平均明顯下調，說明PF能通過抑制VMC模型小鼠心肌細胞凋亡，發揮對心肌組織的保護作用。

NLRP3炎癥小體是由NLRP3蛋白、ASC和caspase-1組成的大分子多蛋白復合體，通常情況下，機體NLRP3活性處于抑制狀態，當NLRP3受外界刺激被激活時，活化的效應蛋白caspase-1可促進IL-1β和IL-18的成熟與釋放，加劇炎癥反應，參與VMC的發生發展［18］。為進一步探究PF改善VMC小鼠心肌損傷的作用機制，本研究對心肌組織中NLRP3炎癥小體通路相關蛋白表達水平以及炎癥因子含量進行了檢測，研究結果顯示，與正常對照組比較，VMC模型小鼠心肌組織中NLRP3、ASC和caspase-1蛋白表達水平以及IL-1β、IL-18和TNF-α含量顯著增加，高劑量PF治療能顯著降低其在心肌組織中的含量，但PF和NLRP3激動劑聯合治療后，PF抑制NLRP3、ASC、caspase-1蛋白表達水平以及IL-1β、IL-18和TNF-α水平的作用降低，提示PF可能通過抑制NLRP3炎癥小體活化減輕VMC小鼠心肌損傷。

綜上所述，PF可通過抑制NLRP3炎癥小體活化，減輕VMC小鼠心肌細胞炎癥反應，減少心肌細胞凋亡，改善CVB3造成的心肌組織損傷，該研究結果可為VMC臨床治療藥物的研發提供實驗依據。