Linc00996通過調控miR-9-5p抑制小細胞肺癌細胞增殖、遷移和侵襲

吳 潔 顧 平 孫 茜 劉 政 梁 蝶 牟晨宇（南京市中心醫院，南京 210018）

肺癌是全球癌癥患者死亡的首要原因，約占所有癌癥死亡的22%［1］。小細胞肺癌（small cell lung cancer，SCLC）約占所有肺癌的15%，具有倍增時間快、生長分數高、早期發生廣泛轉移等特征，即使SCLC初始化療和放療效果較好，但高復發率導致其預后較差，五年生存率不足5%［2-3］。因此，深入研究SCLC的發生機制和治療靶點對提高患者預后尤為必要。研究發現，Linc00996是多發性骨髓瘤的預后生物標志物，大腸癌中Linc00996呈低表達并與遠處轉移和不良預后相關，但其在SCLC中的研究尚無報道［4-5］。因此，本研究深入研究Linc00996在SCLC中的分子功能及潛在機制，為SCLC的靶向治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1材料 人永生化支氣管上皮細胞（HBE）及SCLC細胞系（NCI-H446、N69、SHP-77、DMS79、NCIH345）購自中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫；miR-9-5p mimic、mimic-NC、pcDNA-Linc00996過表達質粒及陰性對照pcDNA-EGF購自上海吉瑪制藥技術有限公司；Lipofectamine?3000、Trizol購自美國Invitrogen公司；反轉錄試劑盒PrimeScript RT reagent Kit購 自 日 本TaKaRa公 司；miScript SYBR Green PCR Kit購自德國Qiagen公司；ECL試劑盒購自北京Solarbio公司；CCK-8試劑購自Beyotime Institute of Biotechnology公司；微量平板閱讀器購自BioTek。

1.2方法

1.2.1細胞培養與轉染 所有細胞均采用含10%FBS的RPMI1640培養基于37℃、5%CO2無菌恒溫環境中培養，細胞密度達80%左右時進行質粒轉染，按照Lipofectamine?3000說明書分別轉染miR-9-5p mimic、mimic-NC、oe-Linc00996和oe-NC。

1.2.2qRT-PCR采用Trizol提取細胞總RNA，反轉錄為cDNA，采用miScript SYBR Green PCR Kit進行qRT-PCR，Linc00996以GAPDH為內參，miR-9-5p以U6為內參，歸一化處理后，2-ΔΔCt計算基因相對表達。引物序列miR-9-5p F：5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3；R：5′-GCGCTCTTTGGTTATCTAGC-3；U6 F：5′-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3；R：5′-GGAACGCTTCACGAATTTG-3；Linc00996 F：5'-CTCTGCCACATCGTTCGGTTC-3′；R：5′-CTTCTTACGCTGCCAACTGCTAA-3；GAPDH：F：5′-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3′；R：5′-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3′。

1.2.3Western blot轉染48 h后收集細胞，加入適量預冷RIPA裂解液冰上裂解10 min，離心收集總蛋白，BCA試劑盒測定蛋白濃度，取等量蛋白進行10%SDS-PAGE凝膠電泳（100 V），移至PVDF膜（60 V、120 min），BSA封閉1 h，加入一抗4℃孵育過夜，TBST洗滌3次，加入辣根過氧化酶標記的二抗室溫孵育2 h，TBST洗滌3次，ECL試劑盒發光自顯影，化學發光系統成像拍照觀察。

1.2.4CCK-8檢測細胞增殖能力 將NCI-H446細胞以5×103個/孔（100μl/孔）接種至96孔板，37℃培養過夜，按照分組轉染不同質粒24 h、48 h、72 h后，加入10μl CCK-8試劑和90μl新鮮培養基取代細胞培養液37℃繼續培養2 h，微量平板閱讀器測量450 nm處吸光度。

1.2.5克隆形成實驗 采用胰酶將NCI-H446細胞消化為單細胞懸液，2×102個/孔接種至6孔板，37℃培養7 d后形成集落，4%多聚甲醛4℃固定1 h，0.5%結晶紫室溫染色30 min，光學顯微鏡下觀察、計數。

1.2.6劃痕實驗檢測細胞遷移 將NCI-H446細胞（5×105個/孔）接種至6孔板，細胞80%融合時采用移液槍槍頭在孔平面輕輕劃過，PBS洗滌3次，去除游離細胞，加入無血清培養基培養24 h，顯微鏡下觀察0 h和24 h細胞遷移情況并拍照。

1.2.7Transwell侵襲實驗 將2×104個細胞懸浮于100μl無血清培養基，接種于預涂Matrigel的小室上部，小室下部加入含10%FBS的800μl RPMI1640培養基，孵育24 h后4%多聚甲醛固定30 min，0.1%結晶紫染色，奧林巴斯IX70倒置顯微鏡隨機選擇5個視野遷移細胞并拍照。

1.2.8雙熒光素酶報告實驗 構建pmirGLOLinc00996-WT質 粒 和pmirGLO-Linc00996-MUT質粒，以含海腎熒光素酶的pRL-TK載體為內參，細胞培養至70%～80%融合時，分別共轉染構建好的野生型質粒和突變質粒、miR-9 mimic及mimic-NC，48 h后收集細胞，加入裂解液，Dual-Luciferase Reporter Assay System檢測熒光素酶活性。

1.3統計學分析 所有實驗均進行3次平行實驗，GraphPad Prism 8.0軟件進行統計學分析，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用方差分析，P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1SCLC細胞系中Linc00996呈低表達qRTPCR檢 測SCLC細胞系 中Linc00996表 達，結 果 顯示，與HBE相 比，SCLC細 胞 系NCI-H446、N69、SHP-77、DMS79、NCI-H345中Linc00996呈顯著低表達（P＜0.001，圖1）。選擇Linc00996表達最低的NCI-H446細胞系進行后續研究。

圖1 qRT-PCR檢測SCLC細胞系中Linc00996表達Fig.1 Linc00996 expression in SCLC cell lines detected by qRT-PCR

2.2過表達Linc00996抑制NCI-H446細胞增殖轉染oe-Linc00996過表達質粒后，Linc00996表達顯著升高（P＜0.001，圖2A），CCK-8檢測發現過表達Linc00996能夠顯著抑制NCI-H446細胞增殖（P＜0.001，圖2B）。平板克隆實驗發現，過表達Linc00996后NCI-H446細胞克隆形成能力顯著減弱（P＜0.001，圖2C）。

圖2 過表達Linc00996抑制NCI-H446細胞增殖Fig.2 Over-expression of Linc00996 inhibits proliferation of NCI-H446 cells

2.3Linc00996抑制NCI-H446細胞遷移 劃痕實驗發現，過表達Linc00996后，NCI-H446細胞遷移水平顯著降低（P＜0.001，圖3A），Transwell實驗發現過表達Linc00996后NCI-H446細胞侵襲水平顯著降低（P＜0.001，圖3B）。Western blot結果顯示，過表達Linc00996后MMP2、MMP9表達顯著降低（P＜0.001，圖3C），表明過表達Linc00996后NCI-H446細胞遷移、侵襲水平降低。

Note：Compared with pcDNA-EGF group，***.P＜0.001.

2.4Linc00996靶向調控NCI-H446細胞miR-9-5p表達Starbase數據庫發現，Linc00996與miR-9-5p存在結合序列（圖4A），qRT-PCR發現，miR-9-5p在SCLC細胞系中呈顯著高表達（P＜0.001，圖4B）。雙熒光素酶實驗發現，miR-9-5p+Linc00996野生型組熒光素酶活性被顯著抑制（P＜0.001，圖4C）。qRTPCR結果顯示，過表達Linc00996后miR-9-5p表達顯著降低（P＜0.001，圖4D），證實Linc00996能夠靶向下調NCI-H446細胞miR-9-5p表達。

2.5過表達miR-9-5p可逆轉Linc00996對NCI-H446細胞增殖的抑制作用qRT-PCR發現，轉染miR-9-5p mimic后，miR-9-5p表達顯著增加（P＜0.01，圖5A）。CCK-8分 別 檢 測control組、pcDNA-Linc00996組、pcDNA-Linc00996+mimic-NC、pcDNA-Linc00996+miR-9-5p mimic組NCI-H446細胞增殖，發現轉染miR-9-5p后能夠逆轉Linc00996對NCI-H446細胞增殖的抑制作用（P＜0.05，圖5B）。平板克隆實驗也證實轉染miR-9-5p能夠逆轉Linc00996對細胞克隆形成能力的抑制作用（P＜0.001，圖5C）。

圖5 過表達miR-9-5p逆轉Linc00996對NCI-H446細胞增殖的抑制作用Fig.5 Over-expression of miR-9-5p reverses inhibitory effect of Linc00996 on proliferation of NCI-H446 cells

2.6過表達miR-9-5p逆轉Linc00996對NCI-H446細胞遷移的抑制作用 劃痕實驗和Transwell實驗發現，同時轉染pcDNA-Linc00996和miR-9-5p mimic能夠逆轉過表達Linc00996對NCI-H446細胞遷移和侵襲的抑制作用（P＜0.001，圖6A、B）。Western blot結果顯示，同時轉染pcDNA-Linc00996和miR-9-5p mimic后MMP2、MMP9表達得到一定程度恢復（P＜0.001，圖6C），表明miR-9-5p能夠逆轉Linc00996對細胞侵襲的抑制作用。

圖6 過表達miR-9-5p逆轉Linc00996對NCI-H446細胞遷移的抑制作用Fig.6 Over-expression of miR-9-5p reverses inhibitory effect of Linc00996 on migration of NCI-H446 cells

Note：Compared with control group，***.P＜0.001.

3 討論

SCLC發展迅速，早期即可發生廣泛轉移，導致患者預后極差。隨著免疫治療技術發展，針對SCLC的免疫治療研究成為新的熱點，且免疫治療能夠使SCLC患者受益［6-7］。因此深入研究SCLC的發生發展機制對SCLC的靶向藥物開發具有重要意義。

長鏈非編碼RNA（lncRNAs）是一類長度為200個核苷酸的非編碼蛋白質的RNA，能夠通過調節轉錄后修飾廣泛參與腫瘤發生發展［8-9］。核lncRNA linc02095可正向調節SOX9轉錄和mRNA輸出，促進三陰乳腺癌惡性進展［10］；SCLC中，ZFPM-AS1能夠競爭性結合miR-3612，上調TRAF4表達可促進SCLC細胞增殖和侵襲［11］；Linc00173能夠靶向吸附miR-218，調節ETK表達，增強SCLC的化療耐藥性并促進其惡性進展［12］。本研究發現，Linc00996在SCLC細胞中低表達，CCK-8、平板克隆實驗、劃痕實驗及Transwell證實過表達Linc00996能夠明顯降低SCLC細胞增殖、侵襲及遷移能力。MMP2、MMP9與腫瘤轉移密切相關，因此本研究通過Western blot檢測MMP2、MMP9蛋白表達，結果顯示，過表達Linc00996可降低SCLC細胞侵襲水平，表明Linc00996在SCLC中發揮腫瘤抑制因子作用。

研究報道，LncRNA通過競爭性結合miRNA調控腫瘤發生發展［13-14］。本研究通過Starbase預測Linc00996的靶向miRNA，發現其能夠與miR-9-5p、miR-758-3p結合，但研究發現miR-758-3p在非小細胞肺癌、膀胱癌、胃癌等多種腫瘤中發揮抑癌作用［15-17］，與本研究假設不符，因此舍棄miR-758-3p。而miR-9-5p在癌癥中發揮促癌作用，因此選擇miR-9-5p進 行 后 續 研 究。qRT-PCR發 現，miR-9-5p在SCLC細胞系中高表達，過表達Linc00996能夠降低SCLC細胞系中miR-9-5p表達。雙熒光素酶實驗和qRT-PCR發現，Linc00996能夠靶向調控miR-9-5p表達。miR-9-5p在SCLC中表達上調，與本研究結果一致［18］。此外，研究報道，miR-9-5p在前列腺癌、非小細胞肺癌、腎細胞癌中均能夠促進腫瘤惡性進展［19-21］。本研究顯示，Linc00996能夠競爭性吸附miR-9-5p，過表達miR-9-5p能夠逆轉Linc00996對SCLC細胞增殖、侵襲及遷移的抑制作用，表明過表達Linc00996能夠通過靶向下調miR-9-5p表達調控SCLC細胞增殖、侵襲及遷移。

綜上，SCLC細胞中Linc00996通過調控miR-9-5p表達進而抑制其增殖、侵襲及遷移，為SCLC免疫治療提供新的思路。