Cag A陽性幽門螺桿菌對胃癌細胞lncRNA DLEU2表達及上皮間質轉化的影響

曲雪，劉琦，趙鑫，邢元欣，郟雁飛，鄭燕，楊煒華，汪運山，韓淑毅

1 山東第一醫科大學（山東省醫學科學院）研究生院，濟南 250117；2 山東大學齊魯醫學院；3 山東第一醫科大學附屬中心醫院醫學實驗診斷中心；4 山東第一醫科大學附屬中心醫院基礎醫學研究中心；5 山東第一醫科大學附屬中心醫院專科轉化研究中心

胃癌是臨床常見的消化系統惡性腫瘤，在全球范圍內其發病率和死亡率分別居第四位、第三位，已成為嚴重威脅人類生命與健康的重大疾病之一。幽門螺桿菌（Hp）感染是目前最明確的胃癌致病因素［1］。細胞毒素相關蛋白A（Cag A）是Hp 的重要毒力因子［2］。有研究報道，Cag A 陽性Hp 感染者胃癌的發病風險是Cag A 陰性Hp感染者的兩倍［3］；Cag A能夠通過調控多種細胞信號通路誘導胃癌細胞增殖、侵襲、遷移并抑制其凋亡［4-5］。長鏈非編碼RNA（lncRNA）是一類轉錄本長度超過200個核苷酸且不具備蛋白編碼功能的RNA 分子［6］。近年研究發現，lncRNA 能夠參與包括胃癌在內多種腫瘤的發生、發展，而Hp 感染可誘導胃黏膜上皮細胞中部分lncRNA 差異表達，這些差異表達的lncRNA 可能在胃癌發生、發展中發揮重要的調控作用［7］。淋巴細胞白血病缺失基因2（DLEU2）屬于lncRNA 家族成員之一，定位于人類染色體13q14區域［8］。本課題組前期生物信息學分析發現，胃癌組織DLEU2 異常表達，并且其異常表達可能與Hp感染有關［8］。2022年1月—7月，我們探討了Cag A 陽性Hp 對胃癌細胞lncRNA DLEU2 表達及上皮間質轉化的影響。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 人胃癌細胞系HGC-27、AGS、MGC-803、MKN-28 以及人正常胃黏膜上皮細胞系GES1，購自中國科學院生物化學與細胞生物學研究所。Hp NCTC標準菌株 26695、11637，由山東大學齊魯醫學院賈繼輝博士惠贈。所有引物序列購自日本Ta?KaRa 公司。LightCycler 480 Ⅱ實時熒光定量PCR儀，購自瑞士Roche公司。逆轉錄試劑盒、熒光定量PCR試劑盒，購自江蘇康為世紀生物科技股份有限公司。Cag A抗體，購自美國GeneTex公司；神經鈣黏著蛋白（N-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）、GAPDH 一抗及其相應二抗，購自武漢愛博泰克生物科技有限公司。

1.2 胃癌細胞與正常胃黏膜上皮細胞DLEU2 表達檢測 將HGC-27、AGS、MGC-803、MKN-28、GES1細胞接種于含10% FBS、1%青鏈霉素雙抗的RPMI 1640 培養基，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的細胞培養箱培養48 h。待細胞貼壁生長至90%融合時，收集細胞。采用TRIzol 法提取細胞總RNA，經紫外可見分光光度計鑒定，OD260/OD280為1.8～2.0、OD260/OD230≥2.0。按逆轉錄試劑盒說明，將總RNA逆轉錄為cDNA。以cDNA 為模板，按UltraSYBR Mixture 試劑盒說明進行PCR 擴增。引物序列：DLEU2 上游引物5'-GGCGGCGGGTACTTATCTC-3'、下游引物5'-CCAGGGAAGGATGTAGCTGTG-3'，GAPDH 上游引物5'-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3'、下游引物5'-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3'。按試劑盒說明配制PCR 反應體系。反應條件：95 ℃10 min，95 ℃ 15 s、61 ℃ 1 min 共45 個循環。PCR 反應結束，繪制熔解曲線，收集循環閾值（CT）數。以GAPDH 為內參，采用2-ΔΔCT法計算DLEU2 相對表達量。選擇DLEU2 相對表達量最高的胃癌細胞進行后續實驗。

取2×107cfu/mL Cag A 陽性NCTC 26695、11637各100 μL，用一次性接種環均勻涂布于彎曲桿菌瓊脂基礎培養基，置于85% N2、10% CO2、5% O2的三氣培養箱。培養3～5天，收集NCTC 26695、11637，加入1 mL無菌PBS 制成細菌懸液，采用麥氏比濁儀檢測細菌懸液濁度。按照感染復數100∶1 將正常胃黏膜上皮細胞、胃癌細胞分別與NCTC 26695、11637 共培養。分別于共培養0、3、9、12 h，按上述步驟檢測DLEU2相對表達量。

1.3 Cag A、N-cadherin、Vimentin 表達檢測 收集與NCTC 26695 或11637 共培養3、9、12 h 時正常胃黏膜上皮細胞和胃癌細胞，加入細胞裂解液提取細胞總蛋白，經BCA 法蛋白定量合格。加入上樣緩沖液，100 ℃水浴變性。取變性蛋白，SDS-PAGE 分離。電泳結束，將蛋白電泳產物轉印至PVDF 膜上。5%脫脂奶粉室溫封閉2.5 h，分別滴加Cag A 一抗及其內參β-actin一抗以及N-cadherin、Vimentin一抗及其內參GAPDH 一抗，4 ℃孵育過夜。次日，加入辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔或小鼠IgG 二抗，室溫孵育45 min，ECL 發光，暗室內曝光、顯影。采用凝膠成像系統拍照，Image J 軟件分析各蛋白電泳條帶灰度值。以β-actin 或GAPDH 為內參，以目的蛋白電泳條帶灰度值與內參蛋白電泳條帶灰度值的比值作為目的蛋白相對表達量。

1.4 統計學方法 采用SPSS25.0 統計軟件。正態分布的計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用Student′s-t檢驗。相關性分析采用Pearson 相關分析法。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 胃癌細胞與正常胃黏膜上皮細胞DLEU2 表達比較 GES1、HGC-27、AGS、MGC-803、MKN-28 細胞DLEU2相對表達量分別為1.00 ± 0.12、3.69 ± 0.51、3.32 ± 0.26、3.17 ± 0.55、2.52 ± 0.19。HGC-27、AGS、MGC-803、MKN-28 細胞DLEU2 相對表達量均高于GES1 細胞（P均＜0.05）。在胃癌細胞中，以HGC-27 細胞DLEU2 相對表達量最高。因此，選擇HGC-27細胞進行后續實驗。

2.2 與NCTC 11637或26695共培養不同時間HGC-27細胞與GES1細胞DLEU2表達比較 見表1。

表1 與NCTC 11637或26695共培養不同時間HGC-27細胞與GES1細胞DLEU2相對表達量比較（±s）

表1 與NCTC 11637或26695共培養不同時間HGC-27細胞與GES1細胞DLEU2相對表達量比較（±s）

注：與同細胞同菌株共培養0 h 比較，*P＜0.05；與同細胞同菌株共培養3 h 比較，#P＜0.05；與同細胞同菌株共培養9 h 比較，△P＜0.05；與同細胞NCTC 26695菌株共培養同時間比較，▲P＜0.05；與GES1細胞同菌株共培養同時間比較，▽P＜0.05。

細胞GES1菌株DLEU2共培養9 h 3.21 ± 0.73*0.47 ± 0.04 1.12 ± 0.12▲1.05 ± 0.02#▽共培養3 h 1.97 ± 0.03*1.62 ± 0.58 0.70 ± 0.03▲▽1.25 ± 0.02 HGC-27共培養12 h 2.14 ± 0.04*#▲0.41 ± 0.00 1.52 ± 0.07*#▽0.59 ± 0.06#△NCTC 11637 NCTC 26695 NCTC 11637 NCTC 26695共培養0 h 1.00 ± 0.06 1.02 ± 0.25 0.93 ± 0.10 1.00 ± 0.17

2.3 與NCTC 11637或26695共培養不同時間HGC-27細胞和GES1細胞Cag A、N-cadherin、Vimentin表達比較 見表2。

表2 與NCTC 11637或26695共培養不同時間HGC-27細胞和GES1細胞Cag A、N-cadherin及Vimentin相對表達量比較（±s）

表2 與NCTC 11637或26695共培養不同時間HGC-27細胞和GES1細胞Cag A、N-cadherin及Vimentin相對表達量比較（±s）

注：與同細胞同菌株共培養3 h比較，*P＜0.05；與同細胞同菌株共培養9 h比較，#P＜0.05。

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2.4 與NCTC 11637 或26695 共培養HGC-27 細胞DLEU2、Cag A 表達與N-cadherin、Vimentin 表達的關系 Pearson 相關分析顯示，與NCTC 11637 共培養HGC-27 細胞DLEU2 表達與N-cadherin、Vimentin 表達均呈正相關關系（r分別為0.98、0.99，P均＜0.05），Cag A 表達與N-cadherin、Vimentin 表達均呈正相關關系（r分別為0.88、0.92，P均＜0.05），并且DLEU2 表達與Cag A 表達亦呈正相關關系（r=0.93，P＜0.05）；與NCTC 26695 共培養HGC-27 細胞DLEU2表達與N-cadherin、Vimentin表達均呈正相關關系（r分別為0.98、0.91，P均＜0.05），Cag A 表達與N-cadherin、Vimentin 表達均呈正相關關系（r分別為0.93、0.98，P均＜0.05），并且DLEU2 表達與Cag A表達亦呈正相關關系（r=0.83，P＜0.05）。

3 討論

胃癌是一種起源于胃黏膜上皮細胞的惡性腫瘤，其發病率和死亡率均居惡性腫瘤前列［1］。Hp 是一種可以長期定植于胃黏膜上皮的革蘭陰性桿菌，能夠引起胃黏膜病變，如萎縮、腸化、異型增生甚至癌變［9］。Hp 感染是目前最明確、最重要的胃癌致病因素［10］，但并非所有Hp 都會引起癌變。Cag A 陽性Hp菌株毒力較強，是胃炎、胃潰瘍、胃癌等疾病的主要致病菌株［11］。因此，明確Cag A 陽性Hp 對胃癌細胞中特異性分子表達的影響，將有助于更好地了解其致癌機制，從而為胃癌診斷與治療提供新的思路。

lncRNA 是一類轉錄本長度超過200 個核苷酸且不具備蛋白編碼功能的RNA 分子［6］。相較于其他非編碼RNA，lncRNA 的生物學功能復雜，能夠調控其他基因以及非編碼RNA 轉錄、轉錄后修飾、蛋白翻譯、翻譯后修飾等過程［12］。有研究報道，胃癌細胞中存在多種lncRNA 表達失調［9］。DLEU2 屬于lncRNA 家族成員之一，定位于人類染色體13q14 區域［8］。DLEU2 在多種惡性腫瘤中具有促癌作用，并且與患者預后不良密切相關［13］。有研究發現，胃癌組織DLEU2 表達顯著升高，并且其異常表達與腫瘤病理分級和TNM 分期顯著相關［14］。有研究還發現，DLEU2 高表達與胃癌患者預后較差密切相關［8］。HU 等［15］研究認為，DLEU2 可通過調控PI3K/Akt 信號通路促進胃癌的發生、發展。本研究結果發現，HGC-27、AGS、MGC-803、MKN-28 細胞DLEU2 相對表達量均顯著高于GES1 細胞，進一步驗證了胃癌細胞中DLEU2 高表達。在胃癌細胞中，以HGC-27細胞DLEU2 相對表達量最高。因此，選擇HGC-27細胞進行后續實驗。

雖然Hp感染是目前最明確的胃癌致病因素，但Hp 感染導致胃癌發生的機制仍不十分清楚［9］。本課題組前期生物信息學分析發現，胃癌組織DLEU2異常表達，并且其異常表達可能與Hp 感染有關［8］。本研究結果顯示，NCTC 11637 感染3、9、12 h 時GES1 細胞DLEU2 相對表達量均高于NCTC 11637感染0 h 時；NCTC 11637 感染12 h 時HGC-27 細胞DLEU2 相對表達量高于NCTC 11637 感染0 h 時。結果提示，NCTC 11637 感染能夠促進GES1 細胞和HGC-27 細胞DLEU2 表達。Hp 可分泌Cag A、Vac A等毒力因子，其中Cag A 陽性Hp 菌株能夠顯著增加胃癌的發生風險［16］。NCTC 26695 感染3、9、12 h 時GES1 細胞或HGC-27 細胞DLEU2 相對表達量與NCTC 26695感染0 h時比較差異無統計學意義。進一步研究發現，NCTC 11637 感染12 h HGC-27 細胞與GES1細胞Cag A相對表達量均高于NCTC 26695，提示DLEU2 表達差異與Hp 菌株進入HGC-27 細胞或GES1 細胞中毒力因子Cag A 多少有關。NCTC 11637 感染GES1 細胞Cag A 相對表達量9 h＞12 h＞3 h；NCTC 26695 感染GES1 細胞Cag A 相對表達量3 h＞9 h＞12 h。NCTC 11637 感染HGC-27 細胞Cag A相對表達量12 h＞9 h＞3 h；NCTC 26695 感染HGC-27細胞Cag A 相對表達量3 h＞9、12 h。NCTC 11637、26695 感染12 h 內Cag A 相對表達量變化與DLEU2相對表達量變化趨勢相同。Pearson相關分析顯示，與NCTC 11637 或26695 共培養的HGC-27 細胞和GES1細胞DLEU2表達與Cag A 表達呈正相關關系。據報道，Cag A 可激活致癌信號通路，從而導致信號通路依賴的癌基因表達上調［5］，而DLEU2 亦可通過信號通路促進胃癌進展。由此推測，Cag A 有可能通過上調DLEU2表達促進胃癌進展。

上皮間質轉化是指上皮表型細胞向間質表型細胞轉化的過程。上皮間質轉化賦予了細胞侵襲和遷移的能力，是胃癌進展的重要原因。N-cadherin 和Vimentin 是上皮間質轉化的標志性蛋白［17］。有研究報道，Cag A 陽性Hp 可導致胃黏膜上皮細胞發生上皮間質轉化［4］，而DLEU2 可促進胃癌細胞遷移和侵襲［8］。本研究結果顯示，NCTC 11637 感染HGC-27細胞N-cadherin、Vimentin 相對表達量12 h＞9 h＞3 h；NCTC 26695 感染HGC-27 細胞N-cadherin、Vimentin相對表達量3 h＞9 h＞12 h。NCTC 11637 或26695 感染12 h 內HGC-27 細胞N-cadherin、Vimentin 相對表達量變化與Cag A、DLEU2 相對表達量變化趨勢相同。Pearson 相關分析顯示，NCTC 11637 或26695 共培養的HGC-27 細胞DLEU2、Cag A 表達與N-cad?herin、Vimentin 表達均呈正相關關系。提示Cag A陽性Hp 可能是推動DLEU2 影響上皮間質轉化的重要原因。

綜上所述，Cag A 陽性Hp 能夠引起胃癌細胞lncRNA DLEU2 異常表達，而DLEU2 異常表達可促進胃癌細胞上皮間質轉化。