西蘭花浙青80的高效制種與純度鑒定技術

王建升，沈鈺森，虞慧芳，盛小光，趙輝，黃志勇，馬存發，武婷，顧宏輝*

(1.浙江省農業科學院 蔬菜研究所，浙江 杭州 310021；2.浙江美之奧種業股份有限公司，浙江 嘉興 314000)

西蘭花是十字花科蕓薹屬甘藍類蔬菜，因花球中含有多種芥子油苷組分，特別是蘿卜硫苷而備受關注[1]。我國是世界上最大的西蘭花生產國、出口國和消費國，種植面積超過8.71 萬hm2[2]。長期以來，日本、美國等國外公司品種壟斷國內西蘭花市場，西蘭花種業“卡脖子”問題嚴峻。2018年農業農村部啟動了西蘭花國家良種重大科研聯合攻關項目[3]。2022年1月根據國家西蘭花良種攻關組統計，國內品種市場占有率已從原來的10%提高到25%左右。國內科研單位和種業公司聯合攻關，育成了一系列具有進口替代潛力的品種[2,4]。然而，在西蘭花制種過程中，普遍存在制種產量低、成本高等問題，國產西蘭花品種產量難以滿足市場需求。

目前，國內外西蘭花商品種主要采用Ogura不育源的雄性不育系制種，不育率可以達到100%[2]，但是仍然存在串粉、機械混雜、親本混有雜株等問題，從而影響雜交種純度。目前分子標記檢測技術已經廣泛應用于作物種子的純度鑒定，其中KASP標記技術是由英國 LGC公司開發的新一代高通量自動化 SNP檢測技術，具有共顯性,顯示 DNA 序列差異，易實現數據整合共享、通量高、單位點檢測成本低等優點，現已成為國際上SNP分型以及插入缺失變異檢測的主要方法之一，并在水稻等作物中已得到了大量應用[5-6]。

浙青80(浙認蔬2019001)是浙江省農業科學院蔬菜研究所于2019年育成的西蘭花新品種[7]，具有花球高圓、蕾粒勻細、低溫不易發紫等優點，花球商品性好，已連續2年被浙江省農業農村廳推介為農業主導品種，可替代進口的中晚熟品種。為滿足市場需求，加快西蘭花國產化進程，本研究在先前制種經驗基礎上，根據浙青80父母本的特征特性，開展了浙青80的播種期、父母本比例、疏球整枝等大棚制種技術研究，實現了我國西蘭花雄性不育系雜交制種產量的歷史突破；同時，建立了浙青80高通量、低成本的KASP分子標記純度鑒定技術，為我國西蘭花雜交制種和種子純度快速鑒定提供了重要參考。

1 材料與方法

1.1 材料

以浙江省農業科學院蔬菜研究所育成的浙青80的父母本為材料，母本為Ougra雄性不育系，父本為雙單倍體材料，本試驗于 2020—2021年在浙江省農業科學院楊渡基地進行。

1.2 制種方法

1.2.1 主要栽培管理

試驗大棚長40 m，寬8 m，共5畦，每畦定植2行，株距45 cm，行距約50 cm。疏球整枝前的肥水管理、病蟲害防治、移栽條件等方法參考先前西蘭花栽培技術[8]，疏球整枝后施45%復合肥一次，每個大棚約10 kg，并化學防治病蟲害。花期采用熊蜂授粉，每個大棚2箱，每箱約100只。授粉結束后，及時清理病殘枝葉、化學防治病蟲。

1.2.2 播種期試驗

花期父母本同時播種，播種期為8月15日(播種期1)、8月25日(播種期2)和9月5日3個播種期(播種期3)。

1.2.3 種植比例試驗

根據以往經驗和文獻報道[9]，本試驗中選擇2個父母本比例，父母本種植比例2∶3(比例1)，父母本比例為1∶4(比例2)。

1.2.4 疏球整枝方式試驗

由于母本側枝極少，選擇對主花球采用2種疏球整枝方式，疏球整枝方式為保留1個小球(疏球1)或兩個小球(疏球2)。

1.2.5 性狀測量與數據統計分析

每個處理隨機選取10株，考察單株枝條數、單株角果數、每角果粒數(統計10個枝條)和大棚實際產量，種子完全收獲后測定千粒重。用 Excel 2010 軟件進行數據統計，并通過SPSS16.0軟件進行方差分析和多重比較(ANOVAP<0.05,Duncan’s test)。

1.3 雜交種KASP標記開發與純度鑒定

1.3.1 KASP標記開發

根據先前西蘭花指紋圖譜庫數據中的100個SNP位點[10]，我們篩選出浙青80父母本的3個特異SNP位點，設計了特異的KASP引物(表1)。

1.3.2 雜交種子純度鑒定

種子發芽10 d以后即可提取待測浙青80的基因組DNA，以提取的DNA為模板，加入特異的引物混合液和通用的KASP預混合液(通用的FRET cassette熒光引物，ROX內參染料，Klear Taq DNA聚合酶，dNTP和MgCl2)，PCR的反應體系為：KASP預混合液5 μL;引物混合液0.14 μL；其中各引物的終濃度均為5 nmol·L-1；20 ng·μL-1模板DNA 5 μL；采用PCR的反應條件為：94 ℃預變性15 min；94 ℃變性20 s，61～55 ℃退火延伸60 s，每個循環的退火溫度降低0.6 ℃，共10個循環；94 ℃變性20 s，55 ℃退火延伸60 s，共26個循環。最后采用熒光檢測儀分析PCR擴增產物。

表1 用于檢測3個SNP位點的KASP引物信息及檢測基因型

每個大棚隨機取89株，并加入2株父本，2株母本，2個對照品種(炎秀、綠雄90)和水為陰性對照，根據基因分型結果(圖1)，判定待測樣本為親本、雜交種或異型株。統計親本、雜交種和異型株的數目，計算浙青80的種子純度。

2 結果與分析

2.1 不同因素對制種產量及產量性狀的影響

播種期在8月25日、父母本比例為1∶4、疏球方式為2時，折合制種每667 m2產量最高為50.67 kg。實際最高制種每667 m2產量為33.35 kg，其播種期也是在8月25日，并采用疏球2方式整枝，父母本比例為2∶3(表2)。

單株枝條數分析結果表明，采用播種期2、父母本比例2、疏球2組合方式時母本的單株枝條數最多，達到83.36個。播種期和父母本比例相同條件下，疏球2的單株枝條數顯著高于疏球1數量，這表明疏球方式對單株枝條數的多少有重要的作用，而且與播種期和比例無關。播種期和疏球方式相同條件下，比例1和比例2之間的單株枝條數差異不顯著，表明父母本比例對單株枝條數沒有顯著影響。疏球方式和父母本比例相同條件下，疏球2、父母本比例1方式下的單株枝條數為播種期2顯著高于播種期3，但播種期1和播種期3無顯著差異；疏球1、父母本比例2方式下的3個播種期之間均存在顯著差異；疏球2、父母本比例2方式下的播種期2均顯著高于播種期1和播種期3，這表明播種期對單株枝條數的多少有影響，而且這種影響與疏球方式和父母本比例有關。

單株角果數分析結果表明，播種期2、父母本比例1、疏球2時最多，播種期2、父母本比例2、疏球2次之。播種期和父母本比例相同條件下，疏球2較疏球1方式的單株角果數更多，除了播種期1、父母本比例2組合種植管理方式下2種疏球方式的單株角果數沒有顯著差異，其他條件的2種疏球方式均存在顯著差異，這表明多數情況下，疏球2相對疏球1能夠提高單株角果數。播種期和疏球方式相同條件下，只有播種期2、疏球2組合方式種植比例1與比例2的單株角果數存在顯著差異，其他比例1和比例2的單株角果數均沒有顯著差異。而比例和疏球方式相同條件下，播種期2的單株角果數最多，但只有播種期2、疏球2、父母本比例1和播種期2、疏球2、父母本比例2顯著高于播種期1和播種期3的單株角果數，這表明播種期對單株角果數的影響受限于特定疏球方式，但與父母本比例無關。

表2 播種期、父母本比例、疏球整枝方式對浙青80制種產量及產量相關性狀的影響

每角果粒數和千粒重的分析結果表明，每角果粒數和千粒重在不同方法之間均沒有顯著差異，暗示當前的制種方式沒有影響每角果粒數和千粒重，也不是造成產量差異的主要因素。

2.2 純度檢測結果

收獲的浙青80雜交種與親本以及3個陰性對照利用SNP8 001、SNP8 002和SNP8 003 SNP標記進行KASP基因分型檢測。結果表明，雜交種的基因分型結果分別為GA、CG、CT，父本分別為GG、CC和CC，母本分別為AA、GG和TT(圖1)，不同大棚中的雜交種純度均為100%。

A—引物SNP8 001；B—引物SNP8 002；C—SNP8 003；左上角小圓圈為加入的父本樣品，右下角小圓圈為母本樣品，中間小圓圈為雜交種，左下角灰色、黑色小圓圈為水和對照樣品。圖1 浙青80雜交種KASP基因分型結果

3 討論

目前，國內外西蘭花制種主要采用Ogura不育源的細胞質雄性不育系雜交制種方式，國內商品種也以雄性不育雜交種為主[1,9,11-12]?？傮w來看，浙青80制種的適宜播種期在8月25日，采用主球保留2個小球的疏球方式，而父母本的比例可以采用2∶3，也可以1∶4，實際制種每667 m2產量分別達到33.35和31.02 kg。根據先前報道，自交不親和制種每667 m2產量在25.7～25.9 kg[11]，雄性不育制種產量在15～30 kg[1,9]，浙青80的制種產量明顯高于先前品種的產量，其原因可能是多方面的，主要包括遺傳因素、天氣(尤其是開花期間)、栽培方法、蜜蜂等，而浙青80是否能夠達到高產和穩產還需要進一步研究。

我們的研究表明，播種期是影響制種的關鍵因素，由于浙青80父本花期略早母本3～5 d，所以在制種時選擇同時播種，但是開花的時間和植株的發育會受到播種期的影響，提前播種會導致花期提前，我們推測由于開花前期溫度低，不適宜蜜蜂活動和授粉受精，從而導致制種產量偏低；播種延后則植株長勢偏弱小，枝條數偏少且花期短，最終也會影響制種的產量。

父母本比例也是西蘭花制種中的重要因素，由于西蘭花采用的是雄性不育制種，雜交種由母本上收獲，適當增加母本的量是常用的措施，先前檀國印等[9]對臺綠1號的父母本制種比例為1∶2或1∶1。由于浙青80父本花期長、花粉量大，我們采用了2∶3和1∶4比例進行試驗，單從最適播種期且采用疏球2方式來看，比例對枝條數沒有顯著影響，但對角果數有影響，所以盡管采用1∶4的父母本比例增加了母本的植株數量，但并沒有增加產量，推測可能是父本量減少，導致花粉量不足，因此，最終單株角果數顯著降低。但從最終產量來看，2種比例對浙青80制種產量的影響不大。

花球高圓緊實是近年來西蘭花育種的主要目標之一[7]，其制種親本往往也多表現高花球圓緊實，然而高圓緊實型的花球常表現抽薹短或者細，開花和角果的數量少，西蘭花疏球整枝是促進抽枝、增加枝條數量和質量的常用手段[9,11]。由于浙青80母本側枝極少，因此，不適合割除整個主球保留側枝的方式制種，我們選擇了保留主球的2個小花球和1個小花球2種疏球方式，保留2個小花球的枝條數、角果數、產量均高于保留1個小花球。

基于前期具有代表性的西蘭花材料的指紋圖譜數據[10]，利用高通量的KASP基因分型平臺，對100個SNP位點進行篩選，根據多態性指數、最小等位基因頻率、基因分型的質量、結果的重復性等指標，篩選出適用于浙青80種子純度鑒定的3個SNP位點，并設計出用于檢測SNP位點的共9條引物序列。利用這9條引物序列，有效區分了親本和對照材料，實現了種子純度和種子真偽的同時鑒別，而且后期田間的表型鑒定也驗證了其可靠性。本研究中KASP檢測方法采用的是96孔板可視化檢測，具有檢測通量高、成本低的特點。

國內育種單位育成品種各有其特征，我們認為西蘭花制種中需要根據父母本的特征特性制定合適的制種方案，包括播種期、疏球整枝方式、父母本比例、種植密度等。另外，未來西蘭花育種時也要將雜交親和性作為一項重要指標，從而為制種奠定良好的遺傳基礎。