重組酶介導的油菜莖基潰瘍病菌熒光核酸擴增檢測體系的建立

陳吳健，張巧琦，魏曉潔，朱青青，郭利川，應清界，梅高甫，曹棟棟*

(1.杭州海關技術中心，浙江 杭州 310016；2.江蘇奇天基因生物科技有限公司，江蘇 無錫 214000；3.浙江省農業科學院作物與核技術利用研究所 浙江省數字旱糧重點實驗室，浙江 杭州 310021)

油菜莖基潰瘍病是油菜上最嚴重的真菌病害之一，油菜莖基潰瘍病菌(Leptosphaeriamaculans)是全世界油菜產區廣泛分布的一種危害嚴重的病原菌，屬真菌界(Fungi)，子囊菌門(Ascomycota)，座囊菌綱(Dothideomycetes)，格孢腔菌目(Pleosporales)，格孢腔菌科(Pleosporaceae)，小球腔菌屬(Leptosphaeria)。油菜莖基潰瘍病菌不僅侵染油菜，還危害白菜、甘藍和芥菜等近30種十字花科植物，引起莖基潰瘍、植株倒伏和死亡。據估計，全世界每年因油菜莖基潰瘍病菌所造成的油菜籽經濟損失超過3億歐元[1-2]。目前該病菌在我國尚未發現，但它可以通過病殘體，特別是被侵染的種子等進行遠距離傳播；近年來我國進口油菜籽主要來源于加拿大、澳大利亞，而我國油菜產區氣候與歐、美、澳三大洲相似，目前的油菜主要栽培品種高度感病[1]。因此，加強口岸檢疫和監管控制是控制該病菌傳入我國的重要手段，是當前我國各口岸植物檢疫部門的緊迫任務[3]，亟需建立一種高效快速檢測體系來預防油菜莖基潰瘍病傳入我國。

核酸擴增技術(recombinase aided amplification，RAA)是一種近年來新出現的等溫核酸擴增技術[4]，使用從細菌或真菌中獲得的重組酶，在37 ℃恒溫下與引物緊密結合，形成酶和引物的聚合體，當模板DNA上搜索到與引物DNA完全互補的序列時，在單鏈DNA結合蛋白的共同作用下，使模板DNA解鏈，并在DNA聚合酶的作用下，合成新的DNA互補鏈。反應產物以指數級增長，一般在15～30 min內即能得到可以用瓊脂糖凝膠電泳檢測到的擴增片段。整個反應簡單快速，不需要高溫循環，常溫下即可完成所有的反應步驟，當室溫低于25 ℃時，只需增加一臺水浴設備，所以非常適合在有大量樣品的非實驗室檢測場景使用。目前RAA技術已經應用在食源性微生物檢測[4-5]、寄生蟲檢測[6]、病毒檢測[7]等方面，本研究建立了一種應用實時熒光RAA法檢測油菜莖基潰瘍病菌的方法，對進境口岸快速檢測鑒定十字花科種子中攜帶的油菜莖基潰瘍病菌具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 菌株

本研究以油菜上常見的病害及其近似菌株為監測對象，菌株均為杭州海關技術中心植檢實驗室分離鑒定(表1)。

表1 供試菌株信息

1.2 序列合成

通過美國國家生物技術信息中心(NCBI)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)，獲得LMR1-D基因堿基序列，并進行多序列比對，從中選出一段352 bp的保守序列(5′-3′)：TACGCGTAAGAA GCGTGCCTTAGAGTCTATAGGGAGCCGCCTAGGTTG CCCTAACCTAGAATCTATAAGGGGAACCTTAGAGG AGCTAGAGTCCTTATCTTCTAATAAGGAGCTCTAGG CGCCCTTAGCTATAGTATTAGCCTTGCGCGTAAGCT TAGCAGCAGTAGTAGTACCTTTTACTAGCTCCTACT ATTTAGCCTTGCTCTCCTTAAGGAGCACTAAGACCC TCTGCTTCTTATCCTTAAGAAGGTCTTAGCTCTTAC CTGCCTACTTCCTTGCTAGGAAGGATAGCGTAGAAT ATTAGGCAAGCTTAGGGCTATTAGTTTGTTAGTATA GATCTTACTAAGCGTTA。將該序列委托上海生工生物工程有限公司合成，載體Puc57，克隆位點SmaI，宿主菌為DH5α，抗性氨芐。

1.3 特異性引物、探針的設計

以LMR1-D基因序列為模板，根據RAA方法的引物及探針設計要求進行引物設計。

1.4 主要設備和試劑

質粒提取試劑盒(天根)；恒溫核酸擴增檢測儀(RAA-F1620，江蘇奇天基因生物科技有限公司)；球磨儀(萊馳MM400)；恒溫振蕩混勻儀(RAA-B6100，江蘇奇天基因生物科技有限公司)；核酸提取試劑盒(天根)；RAA核酸擴增試劑盒(江蘇奇天基因生物科技有限公司)；RAA核酸擴增試劑盒(江蘇奇天基因生物科技有限公司)；引物和探針(上海生工生物工程有限公司合成)。

1.5 RAA反應體系和條件

按RAA核酸擴增試劑盒使用說明進行反應體系的配制，總體積為50 μL，其中反應緩沖液25 μL，超純水16.7 μL，10 mmol·L-1正向引物2.1 μL，10 mmol·L-1反向引物2.1 μL，10 mmol·L-1探針0.6 μL，DNA模板1 μL(陰性對照為水)，充分混合；將混好的緩沖液加到RAA反應單元凍干粉中，使之溶解均勻，瞬時離心；將2.5 μL 280 mmol·L-1醋酸鎂溶液加入到干粉管管蓋上，放入到恒溫振蕩混勻儀(RAA-B6100)，設置溫度為39 ℃，按短振鍵，結束后放入恒溫核酸擴增檢測儀(RAA-F1620)中，設置溫度為39 ℃，反應20 min。

1.6 菌株和樣品DNA的提取

用PDA平板培養供試菌株，3 d后刮取菌絲加液氮研磨后，稱取0.1～0.2 g，用核酸提取試劑盒提取DNA。油菜籽用球磨儀充分粉碎，稱取0.1～0.2 g，用核酸提取試劑盒提取DNA。

1.7 特異性驗證

在8個反應體系中分別加入1 μL陰性質控品、油菜莖基潰瘍病菌、油菜黑脛病菌、蕓苔鏈格孢、鏈格孢、富氏葡萄孢盤菌、蕓苔生尾孢、葡萄莖枯病菌、核盤菌的DNA各1 μL為模板，充分混勻，每管總體積為50 μL，按照RAA熒光擴增體系檢測擴增結果。

1.8 靈敏度的確定

將5 μL 1.0×1010拷貝·mL-1油菜莖基潰瘍病菌DNA質粒10倍梯度分別稀釋成1.0×104、1.0×103、1.0×102、1.0×101拷貝·mL-14個標準樣品；在5個反應體系中分別加入1 μL陰性質控品、4個梯度濃度的標準樣品為模板，充分混勻，每管總體積為50 μL，按照RAA熒光擴增體系檢測擴增結果。

1.9 油菜籽樣品的檢測

在8個反應體系中分別加入1 μL陰性對照、2份澳大利亞油菜籽、2份加拿大油菜籽(經過實時熒光PCR檢測為陽性)、2份經檢測為陰性的本地青菜籽和青花菜籽的DNA各1 μL為模板，充分混勻，每管總體積為50 μL；按照RAA熒光擴增體系檢測擴增結果。

2 結果與分析

2.1 引物和探針

探針和引物的序列設計如表2。

2.2 方法特異性檢測

用表1中的菌株DNA對方法進行特異性檢測，結果如圖1所示。只有油菜莖基潰瘍病菌樣本DNA出現明顯擴增信號，其他樣本及陰性對照均未檢測到擴增。表明本方法具有良好的特異性，可以區分油菜莖基潰瘍病菌與其近似種和油菜上常見的病害。

表2 根據LMR1-D基因保守序列設計的引物和探針

圖1 RAA檢測方法特異性驗證結果

2.3 靈敏度驗證

用實時熒光RAA檢測油菜莖基潰瘍病菌DNA質粒制成10倍梯度的標準品，如圖2所示，最快1 min就可見明顯擴增信號，10 min內所有標準樣品均有擴增。以熒光增加量為熒光起始量的30%為陽性判定標準，可以判定該檢測方法的檢測底限可以達到1.0×101拷貝·mL-1。

圖2 RAA檢測方法靈敏度檢測

2.4 油菜籽樣品的檢測

實際樣品的檢測結果表明，陽性對照和加拿大、澳大利亞油菜籽出現明顯的陽性擴增曲線，本地青菜籽、青花菜籽和陰性對照均無擴增信號，說明該方法不但可以用于監測油菜莖基潰瘍病菌，也可以用于檢測進出境油菜及其產品中是否攜帶油菜莖基潰瘍病菌，而且靈敏度、精確度可以與實時熒光PCR相當(圖3)。

圖3 油菜籽樣品檢測結果

3 討論

油菜是我國種植面積第一的油料作物，自2002年以來一直維持在667 萬hm2左右，產量達1 000萬～1 300萬t。油菜莖基潰瘍病是油菜上最嚴重的真菌病害之一，病原菌主要有油菜黑脛病菌和油菜莖基潰瘍病菌，二者的形態特征相近，但引起油菜莖部感染和基部潰瘍的能力不同。油菜黑脛病菌致病力較弱，一般引起莖中上部為害，造成的損失小，在包括我國在內的一些油菜生產國均有分布[8]。油菜莖基潰瘍病菌致病力強，引起莖基部發病，是導致油菜黑脛病嚴重流行和油菜產量損失的主要因素，在加拿大、澳大利亞、美國、歐洲等油菜主產國均有分布，而在我國未見報道[8]。1975—1995年，油菜莖基潰瘍病菌在加拿大大面積擴散開來，并從美國傳入墨西哥，接著向東擴散，蔓延至大部分歐洲國家[8-10]。因此，隨著國際貿易的發展，帶菌的油菜籽以及病殘體可能隨著大宗的油菜籽進口而進入中國，一旦傳入我國，將對我國油菜產業造成巨大損失。

由于國內油菜籽榨油業產能的擴張迅速，我國油菜籽產量遠遠不能滿足加工需求，且國外價格較低的油菜籽更加刺激了油菜籽進口。據進出口數據顯示，2021年我國油菜籽進口數量為264.64萬t，主要來自加拿大、澳大利亞；因此，油菜莖基潰瘍病菌傳入我國的風險日益增大。上海、廈門以及浙江的多個口岸曾多次從加拿大、澳大利亞進口的油菜籽、青菜籽中截獲到油菜莖基潰瘍病菌[11-13]。為了保護我國油菜產業的健康發展，2007年我國將油菜莖基潰瘍病菌列入《中華人民共和國進境植物檢疫性有害生物名錄》，用檢疫手段嚴防其傳入。

目前實驗室檢測油菜莖基潰瘍病菌的技術主要包括傳統方法，如分離培養法[11]；分子生物學方法，如聚合酶鏈式反應(PCR)法[13-15]、環介導等溫擴增(LAMP)法[12,16]等。分離培養法周期較長，操作繁瑣，較難滿足當前快速通關的要求；PCR技術具有快速、特異性強、靈敏度高的優點，是目前我國口岸篩檢油菜莖基潰瘍病菌的重要手段之一[2]，但需昂貴儀器，裝備精良的實驗室和專業的操作人員；LAMP法所需儀器設備簡單，等溫靈敏、特異性強、操作簡單且易于觀察結果，但是LAMP技術要求多對引物且對靶基因的要求較高。

本研究建立了油菜莖基潰瘍病菌的實時熒光重組酶介導擴增檢測方法，克服了以上的缺點，并通過樣品的驗證表明，該方法方便快捷、靈敏度高、特異性強，能夠檢測到1.0×101拷貝·mL-1的DNA，整個檢測過程為5～20 min，能夠滿足進出境十字花科種子及其產品快速通關的要求。