綠豆種子組織培養的幾種滅菌方法

胡亞群，周琰琰，薛冬，韋雅雯，閆強，袁星星，陳新*

(1.南京農業大學 生命科學學院，江蘇 南京 210095；2.江蘇省農業科學院經濟作物研究所 江蘇省高效園藝作物遺傳改良重點實驗室，江蘇 南京 210014)

綠豆[Vignaradiata(L．)R．Wilczek]屬于豆科(Leguminosae)、蝶形花亞科(Papilionaceae)、菜豆族(Phaseoleae)、豇豆屬(VignaSavi)作物，是主要的食用豆類之一[1]。中國綠豆種植的歷史悠久，種質資源豐富，栽培面積較大，是綠豆的起源中心之一[2]。綠豆的營養價值豐富，是糧菜兼用、醫食同源的經濟作物，因蛋白含量高、脂肪含量低而受到人們的廣泛喜愛[3]。綠豆具有生育期短、耐干旱、耐瘠薄及適應性強等特性，在農業發展和土地養護方面起到重要作用[4]。

轉基因可以有效地選育抗病、抗蟲及抗除草劑的種質資源，而轉基因育種的關鍵是組織培養技術，對種子的滅菌是組織培養的關鍵前提，滅菌效果關系到種子萌發、后續幼苗的長勢及分化。對種子的滅菌不僅要殺死表面的微生物，還要減少滅菌劑對種子本身的傷害，以求得到污染率低、成活率高的外植體[5]。王棟等[6]研究發現，梭梭種子最佳滅菌方法為75%乙醇5 min+0.1%氯化汞8 min。王春梅等[7-8]對苜蓿種子滅菌的研究發現，0.1%氯化汞+10%次氯酸鈉+70%乙醇和10%次氯酸鈉+70%乙醇+1∶15潔爾滅的滅菌方法污染率最低，且后一種方法對操作人員相對安全。高雨靈等[9-11]研究證明，0.1%氯化汞是木棉種子的優良滅菌劑[8]。但以上滅菌手段中所采用的氯化汞屬于劇毒試劑，對環境及人體有危害。

開發高效且環境友好的種子滅菌方式對組織培養有重要意義，很多研究者也進行了積極的探索。侯金艷等[12]研究表明，次氯酸鈉溶液與超聲復合處理為黃連木種子滅菌的理想方法。王一珂等[13]以煙草種子為材料，研究過碳酸鈉對種子的滅菌效果及對無菌苗生長的影響，獲得了較好的滅菌效果。于倩等[14]研究表明，使用75%乙醇60 s、50%次氯酸鈉溶液30 min對白刺種子進行處理，可獲得最好的滅菌效果。陳華濤等[15]研究表明，75%乙醇1 min+5%次氯酸鈉30 min的滅菌方法能有效降低污染率，小豆種子的萌發率也較高，綜合效果最佳。劉海坤等[16]研究表明，氯氣對大豆種子滅菌效果非常理想。

為了探究組織培養體系中綠豆種子滅菌的最佳方式，本研究利用75%乙醇、30%次氯酸鈉、4%過碳酸鈉和氯氣作為滅菌劑，組合搭配8種滅菌方式對綠豆種子進行滅菌處理。對異常株數、萌發率、污染率及叢生芽分化率等指標進行統計分析及綜合評價，旨在選出適宜的滅菌劑及滅菌時間。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

綠豆品種為冀綠7號，由江蘇省農業科學院經濟作物研究所保存。使用基本培養基(MS培養基)用于綠豆萌發、生長情況調查及制備外植體前的萌發。綠豆分化使用B5+抗生素作為分化培養基。

1.2 試驗方法

1.2.1 種子處理

選取健康、飽滿、無破損、大小均勻的綠豆種子分別按照表1進行處理。處理后的種子用無菌水沖洗3～4次，去除殘留滅菌劑。

表1 不同滅菌處理方法分組

1.2.2 種子萌發

將滅菌處理后的種子接種到MS培養基中，每組3瓶，每瓶10粒。每天統計不同處理下綠豆的萌發情況(以下胚軸露出種皮1/2種子大小記為萌發)及污染情況。對生長7 d后不同處理下綠豆植株的主根長、莖長、生物量及異常株數進行統計。

1.2.3 外植體制備

將不同處理的綠豆種子種于MS培養基中，加少量無菌水促進萌發。2 d后，將綠豆的種皮剝下，用刀片切除部分下胚軸(約留子葉節以下1 mm)，沿種臍縱切豆子，將胚和子葉一分為二，使用去掉真葉和葉芽后的部分作為外植體，接種至分化培養基，每組3皿、每皿15個外植體。從3 d開始每隔2 d對不同處理后外植體的污染率進行統計，并及時將未污染的外植體轉接至新的分化培養基中，用于統計外植體的污染情況，同時在第2周統計叢生芽分化率。

1.3 數據統計與分析

接種后定期觀察，統計萌發率、污染率及叢生芽分化率：

萌發率=萌發種子數/接種種子數×100%；污染率=污染種子數/接種種子數×100%；叢生芽分化率=叢生芽數/接種種子數×100%。

采用Excel 2019和IBM SPSS Statistics 20軟件進行數據統計分析和作圖。

1.4 培養基及滅菌劑的配制

MS培養基，調pH至5.8，分裝至組培瓶作為萌發培養基。3.16 g·L-1B5，0.59 g·L-1MES 緩沖液，30 g·L-1蔗糖配制分化培養基，調pH至5.7，高壓蒸汽式滅菌121 ℃ 20 min，滅菌后加1 mg·L-16-芐基腺嘌呤，100 mg·L-1特美汀，100 mg·L-1頭孢噻肟鈉，6 m·L-1草銨膦。

次氯酸鈉用30%濃度，過碳酸鈉用4%濃度。氯氣滅菌方法：將100 mL次氯酸鈉倒進250 mL的錐形瓶中，并將裝有綠豆的平皿放入干燥器中，在干燥器蓋沿磨砂處涂抹凡士林，將蓋子邊沿留有縫隙；使用量筒量取20 mL濃HCl滴定到次氯酸鈉溶液中，留一點濃鹽酸液封，立即密封好干燥器，滅菌3、6 h；帶好手套、口罩，待滅菌完成后，將裝有滅菌綠豆的平皿放置在無菌超凈臺上吹除剩余的氯氣(30 min)，密封好滅菌好的豆子，放置備用。

1.5 處理設計

設置不同滅菌劑及時間共8組，處理后用無菌水洗3遍，接種于MS培養基，用于萌發長勢及污染率對比。另接種30粒左右于MS培養基并加少量無菌水促進萌發，2 d后，制備外植體接種到分化培養基，觀察外植體的污染及分化情況。

2 結果與分析

2.1 滅菌方法對綠豆種子滅菌效果的比較

在所有設置的8種處理組中，只有過碳酸鈉處理的2組在綠豆萌發3 d時出現污染，至7 d污染率分別達到了83%和67%(表2)。這一結果表明，4%的過碳酸鈉不適合用作綠豆滅菌劑。除此之外，只有T3處理組的1個重復中出現了污染，其他均無污染。

2.2 不同滅菌處理對綠豆種子萌發的影響

在處理4 d時，除氯氣處理的2組(T7和T8)各有2粒未萌發外，其余6組處理均全部萌發，且這2組至7 d仍未萌發(圖1、表3)。在接種1 d時，T8處理組未萌發，而T7萌發了3%。這一結果表明，氯氣對綠豆種子傷害較大，影響其萌發，且處理時間越長，對萌發的影響越大。接種1 d時，T1、T3分別比T2、T4發芽率高且T1比T3以及T2比T4萌發率也較高，結果表明，次氯酸鈉、乙醇處理時間的延長，均會導致綠豆萌發的延遲。同時在接種1 d時，T5處理組的萌發率比T6高，結果表明，過碳酸鈉溶液處理時間的延長也會對綠豆的萌發產生影響。綜上所述，不同處理方法對綠豆萌發的影響不同，且同一種滅菌劑隨著處理時間的延長都會導致綠豆萌發的延遲。

表2 不同滅菌方法下綠豆種子的污染率 單位：%

圖1 綠豆種子萌發

表3 不同滅菌處理綠豆種子的萌發率單位：%

2.3 不同滅菌處理對綠豆幼苗生長的影響

T2、T4處理組中綠豆幼苗的主根長及莖長比T1、T3處理下長且生物量也不低于后者，表明在乙醇處理時間相同的條件下，次氯酸鈉滅菌時間的延長不會影響綠豆幼苗的生長(表4)。T3處理組的主根長小于T1處理，然而T4處理組的主根長及莖長大于T2處理，且這4種處理條件下綠豆幼苗生物量之間無顯著差異。此外，過碳酸鈉處理組15 min比30 min長勢好，氯氣處理組2個時間點無顯著差異。這一結果表明，過碳酸鈉處理時間的延長會影響綠豆幼苗的生長，而氯氣處理時間的長短對綠豆幼苗影響較小。

表4 不同滅菌處理對綠豆幼苗生長的影響

在綠豆萌發過程中，幾乎所有處理組中都出現一部分種子萌發后下胚軸生長至2～3 cm后停止發育的現象(圖2、圖3)。次氯酸鈉處理30 min的T2、T4組較同等乙醇處理時間的T1、T3組異常株更多，同時T1比T3處理組且T2比T4處理組的異常株數少，說明隨著乙醇和次氯酸鈉處理時間的延長，均會對綠豆的正常生長產生影響。因此，為了保證綠豆植株的正常生長，在控制污染率的基礎上，應盡量縮短滅菌時間以降低滅菌處理對綠豆生長發育的影響。氯氣處理的T7、T8組也出現了33%和20%的異常株，過碳酸鈉處理的T5、T6組存在60%以上的污染及發育異常，因此，不是綠豆種子有效的滅菌劑。

柱上無相同小寫字母表示處理間差異顯著(P<0.05)。圖4 同。圖2 綠豆萌發過程中異常株比率

圖3 綠豆種子萌發異常株

2.4 不同滅菌處理對綠豆外植體的滅菌效果比較

T5、T6、T7組污染較嚴重，都在80%以上(表5)。其中T6組污染情況最嚴重，在11 d時已經全部污染。這一結果表明，過碳酸鈉和氯氣對綠豆種子滅菌效果較差。T2組最終污染率為4%，是8組中污染率最低的。

表5 不同滅菌處理綠豆外植體的污染率 單位：%

2.5 不同滅菌處理對綠豆外植體叢生芽分化的影響

T6處理組在統計之前就已全部污染，所以未統計其叢生芽分化率。T1～T4處理組叢生芽分化率達到60%以上，其中，T2組最高，分化率達到了82%(圖4～5)。T5、T7污染嚴重且分化率低，T8分化率為80%，但污染率較高且存在未完全萌發的狀況。因此，使用75%乙醇和30%次氯酸鈉組合對綠豆種子進行滅菌處理能夠在控制污染條件下保證叢生芽的分化率。T2組最終污染率為4%，在8組中污染率最低(表5)。因此，用75%乙醇30 s+30%次氯酸鈉30 min對綠豆種子進行滅菌處理是最適合的綠豆種子滅菌方法。

圖4 不同滅菌處理對綠豆外植體叢生芽分化率的影響

圖5 綠豆外植體叢生芽分化

3 小結與討論

在植物組織培養中，對滅菌劑的效果評價指標最主要的是萌發、污染及外植體分化3個方面，本研究分為萌發試驗及外植體分化試驗兩大部分。從萌發試驗來看，2組用過碳酸鈉做滅菌劑的幼苗污染嚴重，氯氣滅菌會造成種子延遲萌發或不萌發。從外植體試驗來看，過碳酸鈉仍會造成大量的污染，氯氣處理組也出現了污染，處理3 h比6 h污染率高，且處理6 h污染率也高達38%，若要繼續延長滅菌時間，必定會引起萌發率降低及發育異常等情況。因此，本研究認為過碳酸鈉及氯氣均不適合作為綠豆種子的滅菌劑。

乙醇加次氯酸鈉滅菌法是常用的聯合滅菌法[9]，75%乙醇+30%次氯酸鈉的滅菌方式在本研究中各項指標均較好，單從萌發試驗來看，T2、T3的萌發速度較T1、T4高，T4存在較多異常株，可能是滅菌時間過長導致。外植體分化試驗中T2、T3組在外植體污染率方面較為突出，T3組在萌發試驗中存在27%的異常株，應為乙醇滅菌時間過長導致，綜上所述，T2組75%乙醇30 s+30%次氯酸鈉30 min是較好的綠豆種子滅菌方式。

組織培養成功的重要因素是降低污染率，對外植體材料的滅菌是關鍵前提，滅菌時間短會造成污染量大，滅菌不徹底的狀況，滅菌時間過長則會導致萌發延遲、發育異常、分化率低等情況。氯化汞雖滅菌效果好，但毒性也大，會對種子造成傷害影響其生長[17]。4%過碳酸鈉水溶液在煙草種子中滅菌效果良好[13]，但本研究發現，在綠豆種子的滅菌中滅菌效果極差，污染率很高。本研究發現，75%乙醇30 s+30%次氯酸鈉30 min是較為安全有效的綠豆種子滅菌方式。