鐵皮石斛組培快繁技術

李得萍，何遠秦，許丁帆，易元慧，董洪雨，劉艷軍

(天津農學院 園藝園林學院，天津 300392)

鐵皮石斛(Dendrobiumcandidum)又稱黑節草，是一種重要的藥用草本植物，具有生津、降血糖、增強機體免疫力等作用，近年愈發受保健品市場的喜歡[1-3]。鐵皮石斛種子細小，沒有胚乳，必須與真菌共生才能萌發，因此，自然繁殖率低[4-5]。早期一般通過扦插、分株的繁殖方式進行鐵皮石斛的生產繁殖[6]，這些常規方式存在繁殖周期長、速度慢等問題，不能滿足生產中對鐵皮石斛種苗的大量需求。而通過組織培養技術進行組培快繁可以極大的縮短繁殖時間，故使用組織培養技術來進行工廠化育苗是解決繁殖率低的理想手段[7]。同時也可通過人工種子技術進行鐵皮石斛的繁殖[8-9]。

鐵皮石斛組培中多采用種子播種[10-11]誘導原球莖進行組培快繁，而本研究采用了誘導鐵皮石斛腋芽萌發的方法，通過不斷剪切帶芽莖段來進行誘導、增殖和生根。與傳統的無菌播種快繁相比，本研究采用的方法有以下三點優勢：首先是成苗的生長勢較強，腋芽直接再生要比從原球莖長出的芽生長勢強，可以直接用于生根，從而縮短了組培的時間；其次，腋芽萌發出來的芽的自然變異率要明顯低于原球莖，從而保障了再生苗的遺傳穩定性，使得組培體系更穩定；最后，此方式的成苗質量高，獲得的再生苗在形態上與母本一樣，高度保持了母本的特性。而通過傳統方法以原球莖進行再生的苗中畸形苗較多，需要長時間的培養才能變成正常苗，進而影響鐵皮石斛的商品價值。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗所用鐵皮石斛盆栽苗由天津農學院園林植物實驗室提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 鐵皮石斛外植體消毒

剪取長度為2～3 cm的鐵皮石斛嫩芽，用70%乙醇溶液浸泡30 s，無菌水沖洗30 s，再分別使用20%、30%、40%的次氯酸鈉水溶液消毒，消毒時間設置為5、10、15、20 min，消毒后無菌水沖洗3次，每次沖洗10 min。最后用無菌濾紙吸干外植體表面水分，將外植體接種到基礎培養基(MS)上。試驗重復3次，每個處理接10瓶，每瓶接種4個外植體。10 d后觀察并統計不同處理的外植體污染率、死亡率。

1.2.2 鐵皮石斛腋芽的誘導

將消毒處理后沒有污染、生長健壯的鐵皮石斛莖段外植體接種到含有不同激素的培養基上，誘導莖段腋芽萌發。培養基以MS為基本培養基，分別添加不同濃度細胞分裂素(BA)、激動素(KT)和萘乙酸(NAA)，6種培養基分別為：①1.0 mg·L-1BA；②1.0 mg·L-1BA+0.5 mg·L-1NAA；③2.0 mg·L-1BA+0.5 mg·L-1NAA；④1.0 mg·L-1KT；⑤1.0 mg·L-1KT+0.5 mg·L-1NAA；⑥2.0 mg·L-1KT+0.5 mg·L-1NAA。每個處理接種10瓶，每瓶接種4個外植體，試驗重復3次。接種后每3 d觀察1次，40 d后統計平均每個側芽誘導系數與再生芽生長情況。

1.2.3 鐵皮石斛腋芽增殖培養

將鐵皮石斛莖段上誘導出的腋芽接種到含不同激素的培養基上進行增殖培養。培養基以MS為基本培養基，分別添加不同濃度分裂素BA和生長素NAA、吲哚丁酸(IBA)，6種培養基分別為：①0.5 mg·L-1IBA；②0.5 mg·L-1IBA+1 mg·L-1BA；③1 mg·L-1IBA+0.5 mg·L-1BA；④0.5 mg·L-1NAA；⑤0.5 mg·L-1NAA+1 mg·L-1BA；⑥1 mg·L-1IBA+0.5 mg·L-1BA。每個處理接種10瓶，每瓶接種4個外植體，每個處理重復3次。接種后每3 d觀察1次，經過40 d后觀察并統計平均每個側芽增殖系數與叢生芽生長情況。

1.2.4 鐵皮石斛的生根培養

將增殖培養中萌發的腋芽長到3～5 cm高時剪下，一部分繼續用于增殖培養，另一部分進行生根培養。將用于生根培養的小苗接種到含有不同生長素的生根培養基上，培養基以MS為基本培養基，分別添加不同種類和不同濃度的生長素IAA(0.5 mg·L-1、1.0 mg·L-1、2.0 mg·L-1)和NAA(0.2 mg·L-1、0.5 mg·L-1、1.0 mg·L-1)，每個處理接種10瓶，每瓶接種4個外植體，每個處理重復6次。接種后每5 d觀察1次，30 d后觀察并統計植株平均生根數、平均根長和生根質量以及植株生長情況。

1.2.5 培養條件

以上培養基均采用5.5 g·L-1瓊脂粉，30 g·L-1蔗糖，pH 5.8～6.0，培養溫度(25±2)℃，光照強度2 000～2 500 lx，連續照明。

1.2.6 數據統計及方法

腋芽誘導系數=誘導形成的腋芽數/接種莖段數；

增殖系數=有效芽數/接種外植體數(有效芽為芽高≥1 cm的芽)。

試驗數據均采用Excel進行處理。

2 結果與分析

2.1 不同消毒處理方法對外植體消毒效果的影響

由表1可知，不同濃度的消毒劑和消毒時間對外植體消毒效果不同。在20%次氯酸鈉消毒液作用下，外植體污染率一直是處于很高的水平，說明在低濃度消毒液下微生物基本不受影響，即使延長作用時間，也不能殺死植株體內的微生物。從外植體生長來看，在低濃度的消毒液作用下除了被微生物侵染造成的生長影響外，外植體沒有出現受消毒液影響而褐變死亡的現象；在高濃度40%的次氯酸鈉作用下，微生物幾乎全被殺死，只有在消毒時間為5 min時有少數外植體出現污染現象，可能是由于消毒時間過短引起的，這說明在此濃度下，微生物不能夠生存，但同時在這種較高濃度的消毒液水平下，幾乎所有外植體都出現了褐變死亡現象，說明在高濃度的消毒液作用下植物材料不能夠正常生長；當采用30%次氯酸鈉消毒時間為10 min時，外植體污染率6%，死亡率0，在外植體污染率較低的前提下也能保證外植體的存活，消毒效果較好。綜合考慮，最適的鐵皮石斛莖段外植體消毒方法為：使用30%次氯酸鈉水溶液，消毒10 min。

表1 不同消毒處理方法對鐵皮石斛外植體消毒效果的影響

2.2 不同培養基對鐵皮石斛莖段腋芽誘導培養的影響

由表2可知，采用不同激素的培養基對鐵皮石斛莖段腋芽誘導的情況差異明顯。在單獨使用BA或KT時，雖然都能誘導出腋芽，但芽細弱、顏色淡綠，說明再生芽內源生長素含量較低，需要在培養基中添加外源激素；當添加NAA后，再生芽健壯，且誘導率高于單獨添加分裂素BA或KT；當使用KT作為分裂素時，誘導出的芽細弱，誘導率不高，同時隨著KT濃度的增加，再生芽出現玻璃化現象，說明KT不適宜鐵皮石斛的生長。使用BA作為分裂素時，誘導出的再生芽生長正常，生長速度快，隨著BA濃度的增加，誘導率也增大，當BA濃度為2.0 mg·L-1時，再生芽生長快且健壯，誘導率5.6。因此，選擇MS+2.0 mg·L-1BA+0.5 mg·L-1NAA作為鐵皮石斛莖段誘導腋芽的誘導培養基。

表2 不同培養基對鐵皮石斛莖段腋芽誘導培養的影響

2.3 不同培養基對鐵皮石斛叢生芽增殖培養的影響

由表3可知，不同激素的培養基對鐵皮石斛叢生芽增殖情況差異明顯。在單獨使用生長素IBA或NAA時，雖然都有一定的增殖，但增殖率不高，且叢生芽生長緩慢，說明叢生芽內源激素含量較低，需要在培養基中添加外源激素；添加BA后增殖系數高于單獨使用IBA或NAA；當使用IBA作為分裂素時，增殖出的芽生長緩慢，再生芽長勢弱，同時加入BA后再生芽的長勢稍好，但生長也緩慢，說明IBA不適宜鐵皮石斛生長；當使用NAA作為分裂素時，再生芽芽勢正常，且生長快，生長素與分裂素比例為1/2時更利于鐵皮石斛的生長，當NAA濃度為0.5 mg·L-1、BA濃度為1 mg·L-1時再生芽長勢健壯、生長快，增殖系數3.8。因此，最佳的增殖培養基為MS+0.5 mg·L-1NAA+1 mg·L-1BA。

表3 不同培養基對鐵皮石斛叢生芽增殖培養的影響

2.4 不同生長素對鐵皮石斛組培苗生根生長的影響

由表4可知，在不同的培養基中鐵皮石斛組培苗生根數量、長度及生根質量明顯不同。在使用IAA作為生根誘導激素時，生根數量較少，根長較短，且誘導出的再生根基本都是短粗、生長緩慢的肉質根，不具有根的功能，移栽時不易成活；在使用NAA作為生根誘導激素時，誘導出的根生長迅速，平均根長明顯長于IAA誘導出的根長，同時誘導出的均為生長正常的根，具有主動吸收功能，可以進行直接移栽。當NAA的用量為0.5 mg·L-1時，平均生根數為7.3條，平均根長達5.8 cm，且都為生長快的正常根。當繼續增加NAA的用量時，再生出的根生長速度有一定的下降，且在個別植株上出現了玻璃化現象，說明高濃度的NAA開始對組培苗產生毒害作用。綜上所述，最佳的鐵皮石斛組培苗生根培養基配方是：MS+0.5 mg·L-1NAA。

表4 不同激素對鐵皮石斛組培苗生根的影響

3 討論

鐵皮石斛再生植株具有多種獲取途徑，常用的方式是使用鐵皮石斛種子進行無菌播種形成原球莖，再通過原球莖增殖分化發育成完整再生植株[12]；也可以通過誘導莖段、莖尖、幼芽或葉片等外植體形成叢生芽來獲取再生植株[13]。本試驗采用后者，以莖段為外植體，建立了一套完整的誘導腋芽萌發、增殖、生根培養快繁體系。

鐵皮石斛使用工廠化生產育苗，可以在一定時間內生產大量整齊度良好的瓶苗[14]。在工廠化育苗中，使用種子擴繁要優于莖段，其優勢主要體現在起始階段的種子外植體感染率較低，且種子的增殖系數顯著高于莖段等。但誘導種子萌發、誘導原球莖所需的周期較長，且因種子是通過雜交授粉得到的，其遺傳性不穩定，由種子再生的植株經過多次繼代受環境以及添加的外源激素的影響易改變其原有的性狀，進而出現性狀分離的現象。以莖段為外植體進行腋芽誘導增殖出來的植株其遺傳穩定性高，能較好地保持原有親本植株的性狀[15]。

本試驗選用30%次氯酸鈉來對莖段進行外植體消毒，消毒10 min外植體污染率為6%，死亡率為0，消毒效果高于其他濃度的次氯酸鈉以及HgCl2等常用消毒液[16-17]；誘導莖段腋芽萌發階段可以通過采用添加一些外源激素來加快其增殖和生長，本試驗誘導培養基為MS+2.0 mg·L-1BA+0.5 mg·L-1NAA，誘導系數5.6，再生芽生長快且健壯，增殖階段采用生長素與分裂數比例為1/2時更適宜鐵皮石斛的生長，叢生芽生長健壯、增殖率高，本試驗增殖培養基為MS+0.5 mg·L-1NAA+1.0 mg·L-1BA，增殖率3.8。綜上所述，本研究以莖段為外植體，優化了鐵皮石斛組培快繁體系，使用莖段誘導腋芽萌發增殖的方法可以成為一種穩定繁殖優株的途徑，為鐵皮石斛繁育和優質種苗生產提供了參考依據。