楊梅果實維生素C與游離氨基酸含量的相關性分析

張啟，梁森苗，王嶸，林瑞，胡佳卉，鄭錫良，戚行江，張淑文*

(1.蘭溪市經濟特產技術推廣中心，浙江 金華 321102；2.浙江省農業科學院，浙江 杭州 310021)

楊梅是楊梅科楊梅屬小喬木，是我國南方著名的特色經濟樹種，主產浙江、江蘇、福建、江西、廣東、廣西等地，具有較高的營養與經濟價值。氨基酸是蛋白質的組分，是許多重要合成途徑的前體物質，是影響食品風味的重要因素，具有甜、苦、酸、澀、鮮等味感，從而形成了風味迥異的食物[1-2]。氨基酸種類、含量及其組成成分的比例是影響食品營養的關鍵因子，也是評價食品質量的重要指標之一[3]。目前氨基酸含量的測定主要有茚三酮比色法[4]、液相色譜法[5-6]、氨基酸儀分析法[7]等，比色法操作簡便，但是只能檢測個別種類氨基酸，生成產物容易不穩定；高效液相色譜法雖然高效通用，但靈敏度低；氨基酸分析儀采用柱后衍生化系統具有選擇性高、針對性強，分析速度快、準確度高等特點。戴宏芬等[8]利用柱前衍生反相高效液相色譜法在4個楊梅品種果實檢測到可統計的14種氨基酸。張澤煌等[9-10]利用氨基酸自動分析儀對不同楊梅品種果實的氨基酸含量進行測定，發現楊梅果實氨基酸種類豐富，共檢測到17種游離氨基酸，且不同種間氨基酸含量差異較大。

維生素C(VC)是人體必不可少的營養元素，人體只能從果蔬中攝取。VC由于其高效的抗氧化性，在人類機體的健康發育及預防眾多疾病中發揮著不可或缺的作用[11]。迄今，植物體內較公認的4條VC合成途徑包括：L-半乳糖途徑(D-甘露糖途徑)、D-半乳糖醛酸途徑、古洛糖酸途徑和肌醇途徑[12]，但楊梅中VC合成途徑尚不明確。本實驗以13份楊梅種質為試驗材料，測定其VC等果實品質指標和游離氨基酸含量，對品質和氨基酸相關性進行分析，明確果實游離氨基酸與品質指標間的相關系數，為楊梅果實VC合成途徑研究提供新參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本實驗采集到13份楊梅種質，文中依次用編號YM1、YM2、YM3、YM4、YM5、YM6、YM7、YM8、YM9、YM10、YM11、YM12、YM13對應表示，其中，YM12為東魁，YM13為荸薺種，其余均為蘭溪市地方種質，暫未命名。在果實成熟期隨機采摘無病蟲害、生長均勻的果實若干，放入保鮮盒運回實驗室，經液氮冷凍后，-80 ℃保存，用于氨基酸和果實品質測定。13份楊梅果實采摘地、顏色、樹體特性如表1所示。

表1 楊梅種質信息

1.2 試劑與儀器

主要試劑：鹽酸、苯酚、不同pH和離子強度的洗脫緩沖液，蒸餾水，乙腈，茚三酮溶液。17種氨基酸溶液混合標準物質，分別為天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、絲氨酸(Ser)、甘氨酸(Gly)、組氨酸(His)、精氨酸(Arg)、蘇氨酸(Thr)、丙氨酸(Ala)、脯氨酸(Pro)、酪氨酸(Tyr)、纈氨酸(Val)、甲硫氨酸(Met)、半胱氨酸(Cys)、異亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、苯丙氨酸(Phe)、賴氨酸(Lys)。

主要儀器：日立LA-8080全自動氨基酸分析儀、氮氣濃縮儀、電熱恒溫鼓風干燥箱、電子天平、紫外分光光度計、游標卡尺。

1.3 試驗方法

1.3.1 氨基酸測定樣品前處理

樣品前處理參照國家《食品安全國家標準 食品中氨基酸的測定》(GB 5009.124—2016)。將保存于-80 ℃冰箱的楊梅果實，用液氮研磨成粉末，準確稱取0.1 g試樣置于水解管中，加入10 mL 6 mol·L-1的鹽酸溶液，3～4滴苯酚，將水解管放入冷凍劑中3～5 min或液氮冷凍至一半結冰，抽真空(接近0 Pa)，充氮氣，重復抽真空-充氮氣3次后，在充氮氣狀態封口。將已封口的水解管放置在(110±1)℃的電熱鼓風恒溫箱中，水解22～24 h，取出冷卻至室溫。

打開水解管，將水解液過濾至50 mL容量瓶中，用少量水多次沖洗水解管，水洗液移入同一個100 mL容量瓶中，用水定容至刻度，搖勻。準確吸取5 mL濾液移入10 mL試管內，用濃縮儀在40～50 ℃加熱環境下減壓干燥，干燥后殘留物用水溶解，再減壓干燥，最后蒸干。將0.02 mol·L-1鹽酸緩沖溶液加入到干燥后的試管內振蕩溶解，渦旋混勻后，吸取溶液過膜，供儀器測定用。混合氨基酸標準溶液和樣品測定液分別注入氨基酸分析儀，以外標法通過峰面積計算樣品測定液中氨基酸的濃度。

1.3.2 氨基酸測定方法

磺酸型陽離子樹脂分離柱(4.6 mm×60.0 mm)，柱溫57.0 ℃，反應器溫度135 ℃，泵A(洗脫溶液)流速為0.40 mL·min-1，泵B(茚三酮溶液)流速為0.35 mL·min-1，進樣量為20 μL，重復3次；檢測波長為570 nm和440 nm。

1.3.3 果實品質測定方法

每份種質資源選取15個果實，用電子天平稱量單果質量，采用游標卡尺測量果實縱徑和橫徑(測量部位為果實中心處十字交叉)，計算果形指數=縱徑/橫徑，總糖、檸檬酸、VC含量使用蘇州科銘生物技術有限公司試劑盒，采用分光光度法測定。

1.4 數據處理和統計分析

所得數據利用統計軟件SPSS 22.0 進行數據和相關性分析，使用Duncan’s 法進行差異顯著分析(P<0.05)，采用Excel 2013進行表格制作。

2 結果與分析

2.1 不同種質楊梅果實品質分析

由表2可以看出13種不同種質楊梅單果重相差較大，單果重在4.38～16.69 g，其中YM12最大，YM9最小，YM12與其他各組組間差異顯著。果實縱徑大小在20.65～28.78 mm，橫徑范圍為20.86～29.2 mm，YM12最大，YM9最小。果形指數是評價果實品質指標之一，果形指數在0.94～1.13。總糖含量最高的為YM2，高達121.26 mg·g-1，最低為YM6，含量為61.67 mg·g-1。果實中酸成分及含量對果實品質有很大的影響，不同楊梅種質果實檸檬酸含量在9.28～14.47 g·kg-1，其中YM12含量最高，YM13最低。不同種質間VC含量差異明顯，在409.5～986.7 mg·kg-1，含量豐富。

2.2 楊梅果實中游離氨基酸含量分析

本次試驗對楊梅果實進行了游離氨基酸定性和定量分析，共檢測出17種游離氨基酸，可統計的有16種(色氨酸在酸水解過程中容易被降解，故未檢測出，半胱氨酸由于是含硫氨基酸，酸解條件下檢測數據不穩定，未統計)。如表3所示，果實總游離氨基酸(total free amino acid,TFAA)變化范圍為4.13～7.55 mg·mL-1，平均為 5.26 mg·mL-1，YM12含量最高為7.55 mg·mL-1，顯著高于其他楊梅品種，其次是YM13，總游離氨基酸含量最低的是YM10為4.13 mg·mL-1。楊梅中包括8種人體必需氨基酸(essential amino acid,EAA)，分別為賴氨酸、組氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、蘇氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、纈氨酸，其中組氨酸為嬰幼兒所必需。必需氨基酸含量在1.70～2.71 mg·mL-1，占總游離氨基酸的35.75%～45.14%。必需氨基酸中含量最高的為賴氨酸，最大占比為22.48%，賴氨酸平均占必需氨基酸總量的21.70%，其次為亮氨酸，平均值為19.35%。其他8種為人體非必需氨基酸(nonessential amino acid,NEAA)，這類氨基酸包括谷氨酸、丙氨酸、甘氨酸、天門冬氨酸、胱氨酸、脯氨酸、絲氨酸和酪氨酸等，介于2.37～4.73 mg·mL-1，占總游離氨基酸的 55.08%～64.25%。非必需氨基酸中含量最高的為天冬氨酸，最大占比為37.09%。天冬氨酸與非必需氨基酸百分比的平均值為24.74%，其次是谷氨酸為21.73%。

表2 不同種質楊梅果實常規品質分析

表3 不同品種楊梅果實游離氨基酸組分含量 單位：mg·mL-1

楊梅果實中還包括一些特殊氨基酸，如藥用氨基酸(medicinal amino acid,MAA)、呈味氨基酸(taste-active amino acid,TAA)等。MAA是植物中含量少，人體不能完全合成，但又是維持機體氮平衡所必需的，包括天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸、甘氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸、賴氨酸等9 種[13]。楊梅果實中藥用氨基酸含量范圍在2.59～4.63 mg·mL-1，均值為3.35 mg·mL-1，YM12含量最大為4.63 mg·mL-1，其次是YM6為4.24 mg·mL-1。TAA包括天冬氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸、甘氨酸和酪氨酸等6種，能使食物呈現出特殊的風味。楊梅TAA含量1.92～3.67 mg·mL-1，YM12含量最高為3.67 mg·mL-1，其次是YM6為3.36 mg·mL-1。TAA含量占總游離氨基酸的43.63%～54.11%，平均占比為48.43%，YM6占比最大，YM1最小(表4)。

表4 不同品種楊梅果實游離氨基酸組分比例 單位：%

2.3 果實氨基酸與VC含量相關性分析

對不同氨基酸與VC含量進行Pearson相關性分析，相關系數如表5所示，楊梅果實游離氨基酸與VC含量間均為負相關關系；除酪氨酸、天冬氨酸、組氨酸之外，其余氨基酸及總游離氨基酸含量與VC含量之間呈現顯著負相關，其中，脯氨酸、絲氨酸、丙氨酸、纈氨酸、甲硫氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸與VC含量之間呈極顯著性負相關。

表5 果實氨基酸與VC含量間的相關性分析

3 討論

氨基酸是果實品質營養價值重要因素之一，也成為評價品質的一個重要方面。果實品質受樹體生長和發育過程營養狀況和環境條件等因素的影響，可通過選育優良品種、提高植株營養狀況和改善生長環境等手段提升營養品質。本研究測定了13份楊梅種質果實VC等品質指標和氨基酸含量，結果表明：必需氨基酸中賴氨酸和亮氨酸含量占比最大，非必需氨基酸中天冬氨酸和谷氨酸占比最大，與朱奕凡等[10]研究結果相似。同時，YM6的呈味氨基酸和藥用氨基酸占總游離氨基酸的比重最大，其風味更濃郁，可作為風味種質資源進行利用。楊梅種質間VC含量差異較大，其中，YM10含量最高，可作為高VC含量種質進行利用。本研究中利用的種質資源具有不同的品質特性，可根據不同目標開展種質創新、雜交選育、功能基因挖掘等工作。楊梅果實中MAA占總游離氨基酸的百分比為61.16%～68.44%，平均值為63.63%，高于紅棗[14-15]，石斛[16]，低于枇杷[17]、枸杞[18]，可為楊梅保健食品開發提供一定的物質基礎。

對品質性狀進行相關性分析的方法在農業科研領域應用廣泛，徐陽等[19]研究了紅美人柑橘果實大小與風味品質的相關性；鄭浩等[20]明確了不同成熟度橄欖果實表觀性狀與內在品質的變化和相關性；劉聰等[21]以蜜瓜為試材，研究不同貯藏溫度對其采后果實質構特性、理化指標、感官品質變化及相關性分析。大量研究分析了品質性狀間的關聯度，而關于品質性狀，尤其是VC含量與氨基酸之間相關性分析研究較少，本研究探析了楊梅種質資源果實VC與游離氨基酸含量間的相關性，結果顯示：脯氨酸、絲氨酸、丙氨酸、纈氨酸、甲硫氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸與VC含量之間呈極顯著性負相關。精氨酸、谷氨酸、甘氨酸、蘇氨酸、苯丙氨酸、總游離氨基酸與VC含量之間呈顯著性負相關，推測楊梅果實VC與上述游離氨基酸合成途徑的調控機制間可能存在競爭關系，因此，我們可開展楊梅果實VC與極顯著負相關的游離氨基酸合成通路研究，明確不同通路間的共同因子和調控關系，再通過外源施加或其他有效措施，提高楊梅果實VC與游離氨基酸含量，提升果實品質。