施肥方式對設施番茄產量及土壤細菌多樣性、群落結構的影響

劉曉梅，蘇文英，紀偉，梁長東，任立凱

(連云港市農業科學院，江蘇 連云港 222000)

近年來，由于設施蔬菜栽培有較高的經濟效益，其栽培面積一直呈上升趨勢，已成為農業增效、農民增收的重要途徑，在我國農業結構化調整中占據重要位置。截至2014年，江蘇省設施蔬菜為主的設施農業面積達到75.7萬hm2，占耕地面積比重達16.5%[1]，其中，蘇北設施蔬菜以產值高的茄果類蔬菜為主，其面積占江蘇65%以上[2]。然而，由于肥料使用過多、連作與重茬等不合理的種植方式，導致土壤鹽漬化、酸化等問題突出，土壤結構被破壞，養分含量失衡，微生物群落結構改變，蔬菜品質與產量逐年下降[3]。因此，逐步優化施肥方式成為今后設施蔬菜可持續發展的必然選擇。

土壤微生物作為土壤生態鏈中的關鍵組成部分，直接參與土壤結構的形成，推動著土壤養分循環和能量流動，在維持土壤生態功能中扮演著重要角色[4]，其中細菌在土壤微生物數量中占有絕對優勢，決定著土壤微生物總量的分布，影響著有機物的分解和轉化[5]。設施蔬菜種植過程中土壤微生物多樣性、群落組成和結構的變化可以作為土壤受損程度和質量變化的重要預警指標，了解土壤微生物及功能群的變化對揭示設施蔬菜栽培條件引起的土壤質量退化微生物學機制及保持設施土壤可持續性具有重要意義。

目前，有關設施番茄土壤微生物的研究主要圍繞種植模式(套種、輪作)[6-9]、養分吸收[10-11]、管理模式[12]等方面。關于不同施肥方式對設施番茄土壤微生物多樣性及群落結構的研究還相對較少。本研究以不施肥為對照(CK)，分析了化肥(T1)、中藥渣有機肥配施化肥(T2)、復合微生物肥料配施化肥(T3)、生物有機肥配施化肥(T4)4種施肥方式對設施番茄產量的影響，并利用Illumina MiSeq平臺，對這4種施肥方式下土壤進行16S rRNA高通量測序分析。探討不同施肥方式對土壤中微生物多樣性和群落結構的變化情況，闡明不同施肥方式對設施番茄土壤細菌群落及各類群間的關系，為本地區設施番茄合理施肥提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗在江蘇省連云港市農業科學院東辛試驗基地塑料大棚中進行。供試土壤基本理化性狀為：pH 7.9，有機質含量19.98 g·kg-1，全氮 1.9 g·kg-1，全磷1.8 g·kg-1，全鉀14.3 g·kg-1。供試作物番茄為粉果，由淮安市農業科學研究院提供。供試肥料為15%金正大復合肥(N 15%、P2O515%、K2O 15%)；中藥渣有機肥含有機質≥45%，N 1.78%、P2O50.92%、K2O 2.63%，由江蘇好徠斯肥業有限公司提供；25%復合微生物肥料(N 10%、P2O57%、K2O 8%)含枯草芽孢桿菌0.2億·g-1，有機質≥6%，由江蘇肥之星生物科技有限公司提供；生物有機肥含巨大芽孢桿菌、固氮類芽孢桿菌、膠凍樣類芽孢桿菌共0.2億·g-1，有機質40%，由揚州森大肥業有限公司提供。

1.2 試驗設計

試驗共設5個處理，T1：每667 m2復合肥160 kg，T2：每667 m2復合肥50 kg+中藥渣有機肥1 000 kg，T3：每667 m2復合微生物肥料250 kg；T4：每667 m2生物有機肥1 200 kg；CK：不施肥處理組。每個處理設4次重復，共16個小區，每小區面積為12.6 m2，每個小區種植三壟，每壟2行，每行8棵(行間距35 cm，株距30 cm)，完全隨機區組設計。開花坐果后每兩周追肥1次，每667 m2追施復合肥10 kg,共7次，每667 m2中微量元素肥(順欣N 15%、P2O515%、K2O 30%、TE)10 kg 共7次。

1.3 土壤樣品采集與分析

土壤樣品采集時間為2019年7月19日，用環刀取各處理耕層(0～20 cm)土壤樣品，每小區多點混合采樣，去除植物根系和石塊裝入無菌袋中帶回實驗室，-80 ℃冰箱保存用于土壤微生物DNA提取。

1.4 各項指標測定

于采收期測定每個小區番茄植株產量，并計算產量。土壤細菌群落分析由上海派森諾生物科技股份有限公司(上海)完成，采用Illumina MiSeq平臺對細菌群落DNA片段進行雙端(Paired-end)測序。

1.5 計算和統計方法

采用QIIME進行土壤細菌群落相關指標分析；采用Excel 2012軟件制圖；采用SAS 9.0對番茄產量及土壤細菌多樣性進行顯著性分析；采用 Qiime 軟件計算Bray-Curtis距離，使用R軟件繪制主坐標分析圖，進行多樣本比較分析。

2 結果與分析

2.1 番茄產量

從表1可以看出T2、T3、T4處理組番茄產量顯著高于T1和CK處理組，三者之間無顯著差異。相較于CK處理組，T1、T2、T3、T4分別增產12.1%、35.3%、39.1%、41.5%，其中T4處理組的番茄產量最高，每667 m2為4 628 kg。

表1 不同處理番茄產量

2.2 土壤細菌群落OTU聚類分析

基于16S rRNA的高通量測序，共獲得有效序列1 811 453，其中T1處理組樣品平均有效序列數為113 814，T2處理組樣品平均有效序列數為126 531，T3處理組樣品平均有效序列數為136 999，T4處理組樣品平均有效序列數為120 436。CK處理組樣品平均有效序列數為106 038，對每組樣品隨機抽取91 276條序列進行抽平，在0.95相似水平下進行聚類，得到每組樣本OTU數。T1土壤中細菌群落OTU數量是10 379，T2土壤中細菌群落OTU數量是10 146，T3土壤中細菌群落OTU數量是8 811，T4土壤中細菌群落OTU數量是10 644，CK土壤中細菌群落OTU數量是9 417。各處理共同的 OTU數為2 055，特有的OTU數相對較多，分別為4 636、3 729、3 270、4 509、3 712，占各處理土壤細菌群落OTU數量的44.7%、36.8%、37.1%、42.4%、39.4%。

2.3 土壤細菌Alpha多樣性分析

土壤樣品的Alpha 多樣性結果見表2。5個土壤樣本覆蓋率均達到99.4%以上，說明測序深度較高，基本能覆蓋樣品中所有物種，能夠真實反映土壤細菌群落組成。細菌群落結構豐富度和多樣性主要是由代表OTUs統計的物種數、表征菌群豐度的Chao1指數、進化多樣性以及反映菌群多樣性的香濃指數和辛普森指數來表示。從表2可以看出，T2處理組土壤Chao1指數、物種數、進化多樣性顯著高于CK處理組；T4處理組的物種數、進化多樣性指數也顯著高于CK處理組，T1、T3處理組與CK無顯著差異。

表2 不同處理下土壤細菌菌群豐度、多樣性指標

2.4 土壤細菌群落的Beta多樣性分析

基于Bray-Curtis距離對不同施肥處理下土壤成分進行主坐標分析(PCoA)，結果顯示第1主成分(PC1)和第2主成分(PC2)的貢獻率分別為29.2%和19.3%(圖1)。主坐標分析二維圖中不同樣本的距離越近，不同樣本中物質組成多樣性越相似。樣本T3、T2和CK距離相近，說明兩個樣本間的物種組成多樣性較為相似。T4、T1與CK的距離較遠，說明T4、T1與CK樣本的細菌群落多樣性差異較大。

2.5 土壤細菌群落結構分析

在門水平上，不同施肥方式下土壤樣品中優勢細菌從高到低依次為變形菌門Proteobactreia、放線菌門Actinobacteria、酸桿菌門Acidobacteria、芽單胞菌門Gemmatimonadetes、擬桿菌門Bacteroidetes、綠彎菌門Chloroflexi、厚壁菌門Firmicutes(圖2)。與CK相比，各施肥處理中變形菌門相對豐度均升高；T2、T3、T4處理組中放線菌門的相對豐度升高；T2、T3處理組中的酸桿菌門、芽單胞菌門的相對豐度升高；僅T1處理組中厚壁菌門的相對豐度升高。僅T2處理組中綠彎菌門的相對豐度升高；T1、T4處理組中擬桿菌門的相對豐度升高。

圖1 不同施肥處理下土壤細菌群落的PCoA分析

圖2 門水平上細菌相對豐度

在屬水平上，不同施肥方式下土壤樣品中優勢菌屬基本相似分別為蒼白桿菌屬Ochrobactrum、MND1、Vibrionimonas、芽單胞菌屬Gemmatimonas、RB41、Gaiella、鞘脂單胞菌屬Sphingomonas、Subgroup10、Iamia(圖3)。與CK相比，各施肥處理中Vibrionimonas、鏈霉菌屬Streptomyces、水沉積物桿菌屬Ilumatobacter的相對豐度均升高，Gaiella的相對豐度均降低；T2、T3、T4處理組中Subgroup 10、Haliangium的相對豐度升高；T1、T3、T4處理組中蒼白桿菌屬、Pelomonas的相對豐度升高；T2、T3中RB41、芽單胞菌屬、消化螺菌屬Nitrospira、MND1的相對豐度升高；T2、T4中Iamia、類諾卡氏菌屬Nocardioides、交替赤桿菌屬Altererythrobacter的相對豐度升高；僅T1中乳酸菌屬Lactobacillus、LachnospiraceaeNK4A136 group、勞爾氏菌屬Ralstonia的相對豐度升高；僅T3中溶桿菌屬Lysobacter、鞘氨醇單胞菌屬Sphingomonas的相對豐度升高。

圖3 屬水平上細菌相對豐度

3 小結與討論

土壤微生物群落結構受植物、微生物與土壤理化環境互作的影響[13]。本研究分析了不同施肥方式對設施番茄產量及土壤細菌多樣性、群落結構的影響。從土壤樣品的Alpha多樣性分析結果可以看出，中藥渣有機肥、生物有機肥配施化肥土壤細菌豐度顯著高于不施肥處理組，與孫家駿等[14]研究結果相似。這是因為，適量施用有機肥能夠顯著提高土壤中有機質、氮磷鉀等養分含量，有利于微生物繁殖，一定程度上提高了土壤微生物的多樣性，改變土壤細菌群落結構[15]。然而，施用化肥以及復合微生物肥料配施化肥土壤細菌豐度和多樣性與不施肥處理無顯著差異，這與蔡杰等[16]的研究一致，其研究發現，未施肥區與常規化肥施肥區土壤微生物多樣性相似。

大量研究表明，不同施肥方式能夠影響土壤微生物類群的相對豐度[16-18]。在本研究中，不同施肥方式下土壤中的優勢菌門基本相似，分別為變形菌門、放線菌門、酸桿菌門、芽單胞菌門、綠彎菌門、擬桿菌門，這與之前的研究結果相似[19-20]，但各處理中優勢菌門的相對豐度具有一定差異，這說明土壤微生物群落結構和多樣性受植物種類、土壤類型等因素的影響[16]。各施肥處理土壤中變形菌門相對豐度均升高，中藥渣有機肥、復合微生物肥料、生物有機肥配施化肥處理組土壤中放線菌門的相對豐度升高，與王慶等[21]、姜蓉等[22]、靳曉拓等[23]的研究結果一致。放線菌是一類具有重要生物活性的功能性微生物，它在各種生態環境中廣泛存在，能產生種類繁雜和富含生物活性的次級代謝產物，還能產生各類酶、有機酸等，有助于分解有機物和礦物質[24];同時它具有良好的抗菌活性和耐鹽堿作用[25-26]。中藥渣有機肥、復合微生物肥料、生物有機肥配施化肥通過提高土壤有益微生物的多樣性，改變土壤微生物的群落結構，維持土壤微生物穩態，促進番茄生長，從而增加番茄的產量。本研究中，相較于不施肥處理組，中藥渣有機肥、復合微生物肥料、生物有機肥配施化肥均能顯著提高番茄產量。

基于土壤細菌群落的 PCoA，發現不同施肥方式下土壤微生物群落分成兩大類，T3、T2和CK距離相近，說明兩個樣本間的物種構成較為相似。T4、T1與其他樣本的距離較遠，說明T4、T1樣本的細菌群落構成與其他樣本差異較大。這說明，生物有機肥配施化肥不僅顯著增加土壤微生物的豐度，還改變了微生物的群落結構；中藥渣有機肥僅顯著提高了土壤微生物的豐度，其微生物群落結構并無太大的變化；施用化肥僅改變了土壤微生物群落構成，微生物的豐度、多樣性并無太大變化，這與之前桑文等[27]的研究結果不同。

綜上所述，不同施肥方式不僅可以影響設施番茄土壤細菌的多樣性與相對豐度，也能在一定程度上改變土壤的細菌群落結構。本研究中，生物有機肥配施化肥對設施番茄的施用效果最好，不僅可以提高番茄產量，還能夠豐富土壤細菌多樣性，改變土壤細菌群落結構，起到改良土壤的作用。