36份新選育玉米自交系抗瘤黑粉病鑒定及抗性遺傳初步分析

肖明綱

(黑龍江省農業科學院生物技術研究所 博士后工作站，黑龍江 哈爾濱 150086)

玉米瘤黑粉病是由玉蜀黍黑粉菌(Ustilagozeae(Beckm.)unger)侵染引起的一種世界性玉米病害，土壤、氣流和種子均可傳播。玉米瘤黑粉病是非系統侵染病害，在玉米生長的各個階段均可發生。玉蜀黍黑粉菌主要通過傷口侵染植株的所有地上組織，被侵染部位形成形狀各異、大小不一的腫瘤[1]。瘤黑粉病是我國玉米生產中的重要病害，在我國普遍發生[1-2]，發病率一般5%～10%，嚴重時可造成30%～80%的產量損失[3]。近年來，多年秸稈還田、西北玉米區常年連作及推廣品種缺乏抗病性等原因導致土壤中病害初侵染源急劇增加，各地瘤黑粉病發生呈逐漸加重趨勢，特別是在夏玉米區和西北玉米制種區，瘤黑粉病對玉米生產的影響越來越大[4-8]。河北省隆堯縣2014年玉米瘤黑粉病大發生，田間植株發病率高達14.5%，嚴重降低玉米產量[9]。2015年由于玉米品種抗性弱，連年重茬造成病原菌積累，玉米瘤黑粉病在云南省大關縣大發生，一般地塊發病率達到3%～8%，嚴重地塊產量損失達30%～40%[10]。2016年玉米抽雄后強烈降雨導致河北省玉米瘤黑粉病大面積暴發，果穗感病嚴重，造成玉米大面積減產達50%以上[11]。因氣候條件適宜，再加之感病品種的種植，玉米瘤黑粉病在安徽省北部地區的發病率呈逐年上升趨勢，自然發病率從2011—2016年由3.5%上升到5.3%，嚴重影響當地玉米生產[12]。2014—2016年期間，東北三省前期高溫干旱，中后期低溫多雨，導致玉米瘤黑粉病普遍發生，受侵染玉米面積高達995.33 萬hm2。其中，黑龍江省玉米瘤黑粉病發病最為嚴重，造成的經濟損失也最大[13]。2015—2017年玉米瘤黑粉病在甘肅省天水市各玉米產區普遍發生，田間病株率在5%～12%，嚴重地塊造成玉米減產率高達15%以上[14]。國家玉米產業技術體系2019年調研結果表明，玉米瘤黑粉病的發生和危害在東北各玉米產區逐年加重。因此，防治玉米瘤黑粉病的發生和危害是玉米減損增效的重要舉措。

選育抗病品種是控制玉米瘤黑粉病發生和危害最經濟有效的措施，而豐富的抗病種質資源則是抗病育種的材料基礎。為此，國內很多學者對于玉米瘤黑粉病抗性種質資源篩選和鑒定做了大量工作。姜曉穎等[15]對21個骨干自交系人工接種鑒定，發現17份抗病材料，其中9份材料高抗玉米瘤黑粉病。薛春生等[16]采用人工接種方法，評價了19個玉米骨干自交系對瘤黑粉病的抗性，發現8份抗病材料，占比為42%。段燦星等[17]對836份玉米種質資源進行了抗玉米瘤黑粉病鑒定與評價，共篩選出275份抗玉米瘤黑粉病材料，占鑒定總材料的32.9%。嚴理等[18]采用苗期注射人工接種方法對22個玉米品種瘤黑粉病抗性初步鑒定表明，高抗和中抗品種各2個，抗病品種12個，抗病品種占比較高，達到73%。王澤浩[6]采用冬孢子粉菌土法評價了45份玉米品種親本對瘤黑粉病的抗性，鑒定結果表明，所有材料對瘤黑粉病都具有抗性。賈嬌等[19]田間調查了71份新選玉米自交系對瘤黑粉病的抗性，85.9%的材料對玉米瘤黑粉病具有抗性，其中高抗材料36份，抗病材料24份。施艷等[20]評價了河南省2015—2017年456份玉米區域試驗參試品種對瘤黑粉病的抗性水平，結果表明，玉米瘤黑粉病抗病品種鑒定結果在不同年份中差異較大，2015年和2016年以感病品種為主，2017年以中抗品種為主。周天旺等[21]利用田間人工接種方法評價了47份鮮食玉米對瘤黑粉病的抗性，結果表明，鮮食玉米新品種中抗瘤黑粉病品種比較豐富，47份鮮食玉米雜交種中僅有5份材料表現感病。郭成等[22]于2019年通過人工接種對42份鮮食玉米進行田間抗性鑒定，在鮮食玉米上，對瘤黑粉病抗性品種較為匱乏，42份品種中僅有5份材料表現抗病。于玲玲等[23]對新選育的20份玉米自交系進行抗瘤黑粉病鑒定，結果表明，僅有H7、H9、H12、H13和H19等5份材料抗玉米瘤黑粉病。王鐵兵等[24]研究了30份玉米自交系對瘤黑粉病的抗病性，發現僅有7份材料表現為抗病，其余23份均表現為感瘤黑粉病。段燦星等[25]首次對2 000份來源廣泛且遺傳背景豐富的玉米種質資源進行了多年多點玉米瘤黑粉病的田間自然發生條件下抗病性鑒定，結果表明，玉米瘤黑粉病的發生受環境條件影響較大，需要后續人工接種精準鑒定。張文潔[26]利用人工注射接種瘤黑粉冬孢子的方法對204份玉米自交系進行瘤黑粉病抗性鑒定，結果表明，抗性材料較少，占比僅為34.31%，感病自交系所占比例較大，達到65.69%，且不同玉米種質對瘤黑粉病的抗性存在差異。

隨著基因組學和生物信息學的發展，國內外學者開展了玉米抗病基因定位與克隆工作，但關于玉米瘤黑粉病抗性基因定位和克隆的研究較少。Lübberstedt等[27]采用復合區間作圖法，利用122個RFLP標記進行了玉米抗瘤黑粉病的QTL定位，共發現19個不同的QTLs。Kerns等[28]采用單因素回歸分析法，利用146個RFLP標記對玉米瘤黑粉病進行了QTL定位，鑒定出5個與瘤黑粉病相關的染色體區段。Baumgarten等[29]利用重組自交系群體，定位到了抗玉米瘤黑粉病的QTLs，這些抗病相關位點分布在除第6染色體以外其余9條染色體上。Ding等[30]利用重組自交系群體，定位到6個加性效應QTLs，分布在第3、5、8染色體上。呂愛枝等[31]的片段代換系研究結果則顯示，chr3-7、chr3-1和chr3-6分別在phi046(bin3.08)、phi049(bin3.01)和umc1644(bin3.06)位點表現為高抗、中抗和感病。姬東華[32]以F2∶3家系為作圖群體，采用復合區間作圖法初步定位玉米瘤黑粉病相關抗性基因，共檢測到5個QTLs，表型貢獻率范圍為1.97%～28.68%。梁爽[13]利用Ici Mapping軟件對玉米瘤黑粉病進行QTL定位分析，結果共檢測到6個玉米抗瘤黑粉病QTLs，表型貢獻率為4.729 7%～7.612 8%。

目前玉米瘤黑粉病在我國各玉米種植區發生越來越普遍，危害也越來越嚴重，針對這種情況，我們利用人工接種方法，對新選育的32份玉米種質資源進行玉米瘤黑粉病抗性鑒定和評價，并對高抗種質資源進行連續多年鑒定，探究其真實抗性水平，以期為玉米抗瘤黑粉病新品種培育篩選有效種質資源；利用F2群體對高抗瘤黑粉病材料進行抗性遺傳分析并初步定位抗病基因，豐富抗玉米瘤黑粉病基因資源，為抗病基因的進一步利用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 供試自交系

36份新選育的穩定玉米自交系。抗病鑒定對照材料齊319高抗玉米瘤黑粉病，掖478高感玉米瘤黑粉病。2018—2020年連續3 a對這些玉米材料進行了抗瘤黑粉病鑒定，抗性評價以3 a數據最高級別計算。

1.2 供試病原菌

玉蜀黍黑粉菌(Ustilagozeae)分離自黑龍江省玉米發病組織，由本課題組采集、分離、純化、培養并保存。

1.3 抗病鑒定圃設置

玉米抗瘤黑粉病鑒定圃設在哈爾濱呼蘭區，鑒定材料順序排列，每份材料種植4行，行長5 m，行距0.65 m，每行留25～30株，株距略小于大田生產，每份材料至少保苗100株，田間正常管理。在玉米展6～8葉期，采用注射法接種，7 d后進行第2次接種，乳熟后期進行抗性調查。

1.4 人工接種及抗性評價

接種體制備、具體接種方法、反應分級及抗性評價標準參見《玉米病蟲害田間鑒別手冊》[1]。

1.4.1 玉米瘤黑粉病接種體準備

在田間采集玉米瘤黑粉病植株上的未破裂菌體，放置通風處陰干，在干燥條件下保存。接種前，將保存的瘤體破碎，并將厚垣孢子團充分碾碎，用50目細籮過篩，使病原菌成為均一的菌粉。在直徑90 cm培養皿中放置2～3層濾紙并充分浸潤，每皿均勻撒入0.2 g菌粉。25 ℃下保濕72 h，然后將每皿的菌粉洗入1 L水中，配制成濃度約為1×105孢子·mL-1接種液，接種液中加入0.5 g·L-1的葡萄糖[1]。

1.4.2 玉米瘤黑粉病人工接種方法

在玉米6～8葉期時采用注射法人工接種。接種時，在植株中部接近生長點的部位從外向內且刺入心葉內，每株注射菌液2 mL。1周后進行第二次接種，接種后田間正常管理[1]。

1.4.3 玉米瘤黑粉病抗性評價

在玉米進入乳熟后期進行調查，逐株調查每份材料，分別記載調查總株數、發病株數，計算和記載發病株率。發病株率0%～1.0%為1級(HR)，發病株率1.1%～5.0%為3級(R)，發病株率5.1%～10.0%為5級(MR)，發病株率10.1%～40.0%為7級(S)，發病株率40.1%～100%為9級(HS)[1]。

1.5 高抗玉米瘤黑粉病材料抗性遺傳初步分析

用高抗玉米材料與感病自交系掖478雜交，產生F2分離群體，在玉米6～8葉期時人工接種相應的F2群體和感病對照掖478，1周后第二次人工接種，乳熟后期調查每個F2單株發病狀況[1]。計算各群體抗、感個體的分離比例，用SAS 8.2軟件(SAS Institute，Raleigh，NC，USA)計算分離比例的χ2值和概率值，進行分離比例的適合性測驗。

2 結果與分析

2.1 引進材料對瘤黑粉病的抗性鑒定與評價

2018年和2019年連續2 a采用注射法評價了36份玉米自交系對瘤黑粉病的抗性，抗病對照齊319發病株率分別為0和0.8%，表現為高抗，感病對照掖478感病株率為89.3%和89.1%，表現為高感，抗、感對照發病率差異明顯，鑒定結果有效。在36份待鑒定材料中，共篩選到19份玉米自交系對瘤黑粉病具有抗性，占鑒定材料的52.8%。其中高抗材料11份(Z16HEB-325、Z16HEB-328、Z16HEB-330、Z16HEB-333、Z16HEB-339、Z16HEB-342、Z16HEB-347、Z16HEB-349、Z16HEB-350、Z16HEB-352和Z16HEB-356)，占鑒定材料的30.6%；中抗材料2份(Z16HEB-335和Z16HEB-345)，占鑒定材料的5.6%；抗病材料6份(Z16HEB-322、Z16HEB-324、Z16HEB-326、Z16HEB-337、Z16HEB-344和 Z16HEB-354)，占鑒定材料的16.7%；感病材料11份(Z16HEB-323、Z16HEB-327、Z16HEB-331、Z16HEB-334、Z16HEB-336、Z16HEB-338、Z16HEB-340、Z16HEB-341、Z16HEB-346、Z16HEB-348和Z16HEB-353)，占鑒定材料的30.6%；高感材料6份(Z16HEB-321、Z16HEB-329、Z16HEB-332、Z16HEB-343、Z16HEB-351和Z16HEB-355)，占鑒定材料的16.7%(圖1)。鑒定結果表明，在新選育的36份玉米材料中，有豐富的玉米瘤黑粉病抗源，可用于抗病親本的選育及抗病材料的改良，以減輕玉米瘤黑粉病的危害，減少制種成本，提高制種產量。

圖1 新選玉米自交系瘤黑粉病抗性級別分布

2.2 外引高抗材料抗玉米瘤黑粉病重復鑒定

2020年對11份高抗玉米瘤黑粉病材料又進行了重復鑒定，感病對照掖478發病株率為87.1%，抗病對照齊319發病株率為0，抗、感對照充分發病，人工接種鑒定有效。結果發現，自交系Z16HEB-325、Z16HEB-328、Z16HEB-330、Z16HEB-333、Z16HEB-339、Z16HEB-342、Z16HEB-347、Z16HEB-349、Z16HEB-350、Z16HEB-352和Z16HEB-356共11份材料3 a間玉米瘤黑粉病抗性表現穩定，反映了其真實抗性水平(表1)。這些自交系可作為玉米抗瘤黑粉病的重要抗性資源，以拓展我國玉米抗瘤黑粉病種質的遺傳基礎。

2.3 高抗玉米瘤黑粉病材料抗性遺傳分析

11份高抗自交系與感病對照掖478配制雜交組合，人工接種F2群體，F2單株對玉蜀黍黑粉菌的抗感表現結果表明，組合掖478/Z16HEB-325、掖478/Z16HEB-333、掖478/Z16HEB-339、掖478/Z16HEB-347和掖478/Z16HEB-352的F2群體抗感植株比例都符合3∶1的分離比，而組合掖478/Z16HEB-328、掖478/Z16HEB-330、掖478/Z-16HEB-342、掖478/Z16HEB-349、掖478/Z16HEB-350和掖478/Z16HEB-356的F2群體抗、感植株比例不符合3∶1的分離比(表2)，說明自交系Z16HEB-325、Z16HEB-333、Z16HEB-339、Z16HEB-347和Z16HEB-352對玉蜀黍黑粉菌的抗性可能受1對顯性單基因控制。

表1 11份玉米自交系對玉米瘤黑粉病多年抗性鑒定

表2 11個F2群體對玉蜀黍黑粉菌的抗性反應

3 小結與討論

玉米瘤黑粉病屬于土傳病害，一旦傳入就很難根除，防治起來也十分困難。玉米瘤黑粉病在整個生育期都能發生，田間噴藥也很難奏效，同時從生產成本和環境保護角度看，化學方法也不能作為防治玉米瘤黑粉病的首選措施。

連續2 a人工接種鑒定評價了36份玉米自交系對瘤黑粉病的抗性，共篩選到19份玉米自交系對瘤黑粉病具有抗性，占鑒定材料的52.8%，其中高抗材料11份，且抗性穩定，感病材料17份，占鑒定材料的47.2%。這些抗病資源將會在一定程度上拓寬我國玉米抗病種質遺傳基礎，對我國玉米抗病資源創制及抗病品種培育具有重要的應用價值。

11份高抗自交系與感病對照掖478配制雜交組合，人工接種F2群體，利用F2群體抗感表現型對11份高抗玉米瘤黑粉病材料進行抗性遺傳分析，結果表明，組合掖478/Z16HEB-325、掖478/Z16HEB-333、掖478/Z16HEB-339、掖478/Z16HEB-347和掖478/Z16HEB-352的F2群體抗感植株比例都符合3∶1的分離比(表2)，說明自交系Z16HEB-325、Z16HEB-333、Z16HEB-339、Z16HEB-347和Z16HEB-352對玉蜀黍黑粉菌的抗性可能受1對顯性單基因控制。

盡管質量抗性基因和數量抗性基因有著明顯的不同，但是在某些情況下，質量抗性基因更像是一個主效QTL[33-34]。自交系Z16HEB-325、Z16HEB-328、Z16HEB-330、Z16HEB-333、Z16HEB-342、Z16HEB-347、Z16HEB-350、Z16HEB-352和Z16HEB-356年際間感病植株百分率均有波動，而自交系Z16HEB-339和Z16HEB-349年際間感病植株百分率比較恒定，均為0.8%(表1)，但病瘤數量、病瘤大小和病瘤產生部位可能有差異。僅根據病情級別，自交系Z16HEB-325、Z16HEB-333、Z16HEB-339、Z16HEB-347和Z16HEB-352對瘤黑粉病的抗性可能受一對顯性單基因控制，而如果綜合考慮病情級別、病瘤大小、病瘤數量、危害程度及環境因素，自交系Z16HEB-325、Z16HEB-333、Z16HEB-339、Z16HEB-347和Z16HEB-352對瘤黑粉病的抗性也可能受少數主效QTLs控制，存在微效基因的作用。下一步將重點開展質量單基因或主效QTL位點的定位。