羊肚菌白霉病病原鑒定及生物學特性研究

蘇文英，劉曉梅，紀偉，梁長東，趙書光，任立凱*

(1.連云港市農業科學院，江蘇 連云港 222006；2.灌南縣農業技術推廣中心，江蘇 連云港 222006)

羊肚菌(Morchella)是一種珍稀食藥用菌，在菌物分類學上隸屬于子囊菌亞門(Ascomycota)、盤菌綱(Discomycetes)、盤菌目(Pezizales)、羊肚菌科(Morchellaceae)、羊肚菌屬(Morchella)[1]。羊肚菌風味獨特，營養價值極高，富含多種蛋白質及人體所需氨基酸，具有抑制腫瘤、調節機體免疫功能，能夠抗疲勞、保肝、保腎、調血脂及保護胃腸功能等作用，具有重要的經濟價值[2-3]。由于羊肚菌產業成本低、見效快、效益高的優勢，其栽培區域由最初的川渝地區迅速擴張，現如今全國各地除海南以外的各省份均有種植[4-5]。羊肚菌屬于土腐生類型，菌絲體需要在土壤中的有機物、無機物、水分及各種微生物的作用下才能出菇。因此，羊肚菌大田栽培占全行業栽培的90%以上，整個栽培過程羊肚菌菌絲體及子實體都暴露在外界環境中，與環境中的各種生物體接觸，容易招致各種病蟲害侵襲，給生產帶來損失。此外，在栽培管理后期，高溫高濕的環境也會加劇病害的發生和蔓延[6]。

近幾年，羊肚菌病害在全國范圍內頻發，病害種類包括細菌性病害和真菌性病害，細菌性病害主要為軟腐病及紅體病；真菌性病害主要為白霉病。羊肚菌白霉病是其子實體時期最主要的病害，發病時子實體受侵染部位被白色絨毛狀菌絲覆蓋，嚴重時子實體受侵染部位會枯萎，病害發生率達60%～80%，使羊肚菌的商品性狀和經濟價值大打折扣，給種植戶帶來巨大的經濟損失。此外，羊肚菌白霉病菌適應性極強，且能快速傳播，一旦發病極難控制。因此，掌握羊肚菌白霉病病原菌的物種歸屬及生物學特性，對于該病害的預防和控制及進一步提升羊肚菌種植的經濟效益具有一定的實踐指導意義。

本研究通過對羊肚菌白霉病病原菌的分離鑒定及生物學特性進行研究，以期為該病害的早期診斷和科學防治提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

2020年3月在江蘇省連云港市農業科學院試驗基地，采集發病子實體并帶回實驗室，觀察記錄病害癥狀。

1.2 供試培養基

MYG培養基(稱取10 g麥芽糖、5 g葡萄糖、5 g酵母浸粉、15 g瓊脂，加入蒸餾水定容至1 L)；基礎培養基(稱取20 g葡萄糖、10 g蛋白胨、1 g K2HPO4、0.5 g MgSO4、15 g瓊脂，加入蒸餾水定容至1 L)；馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養基(稱取200 g馬鈴薯、20 g葡萄糖、15 g瓊脂，加入蒸餾水定容至1 L)；薩氏(SDAY)培養基(稱取10 g酵母浸粉、40 g葡萄糖、10 g蛋白胨、15 g瓊脂，加入蒸餾水定容至1 L)；察氏(Czapek)培養基(稱取2 g NaNO3、1 g K2HPO4、0.5 g KCl、0.5 g MgSO4、0.01 g FeSO4、30 g蔗糖、15 g瓊脂，加入蒸餾水定容至1 L)，所有培養基均在121 ℃下高壓滅菌20 min。

1.3 病原菌的分離與鑒定

采用組織分離法進行病原菌的分離和純化，在超凈工作臺中，用75%乙醇棉擦拭病害子實體表面，用接種刀切取病健交界處1～2 mm的組織塊置于MYG平板內于25 ℃下恒溫培養。待組織塊周圍生長出菌絲，切取尖端菌絲轉至新的MYG培養基純化培養。共獲得1個菌株標記為JS-1，菌株在MYG培養基上培養10 d后置于4 ℃保藏備用。

利用基因組DNA提取試劑盒(北京康為世紀生物科技有限公司，北京)提取病原真菌DNA，選擇通用引物ITS1、ITS4對提取的DNA進行擴增，擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測正確后送至生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序，測序結果進行BLAST同源性比對。通過比對測序結果，選取相似性較高的菌株相關種屬序列，利用MEGA 7.0構建系統發育樹。

將菌株JS-1接種于MYG平板上，25 ℃恒溫暗培養10 d，觀察記錄菌落特征及顯微形態。

根據柯赫氏法則進行回接致病性檢測。

1.4 病原菌生物學特性測定

1.4.1 不同培養基對病原菌菌絲生長的影響

用8 mm打孔器在致病菌菌落邊緣打孔，將菌塊分別接種于PDA培養基、SDAY培養基、MYG培養基、Czapek培養基上，每個處理5個重復，于25 ℃恒溫暗培養。培養期間觀察記錄菌絲均勻度及密度等長勢情況，并計算菌絲生長速率。

1.4.2 碳源試驗

分別以等量麥芽糖、淀粉、蔗糖、乳糖替換基礎培養基中的葡萄糖，121 ℃滅菌20 min后倒入培養皿中，待培養基凝固后，用直徑8 mm的打孔器取菌塊接種于平板中央，每個處理5個重復，25 ℃恒溫條件下黑暗培養，觀察并記錄菌絲長勢。

1.4.3 氮源試驗

分別以等量硫酸銨、酵母浸粉、氯化銨、尿素替換基礎培養基中的蛋白胨，121 ℃滅菌20 min后倒入培養皿中，待培養基凝固后，用直徑8 mm的打孔器取菌塊接種于平板中央，每個處理5個重復，25 ℃恒溫條件下黑暗培養，觀察并記錄菌絲長勢。

1.4.4 溫度試驗

將接種后的平板培養皿分別置于15、20、25、30、35、40 ℃條件下培養，每個處理5個重復(培養基為基礎培養基)，觀察并記錄菌絲長勢。

1.4.5 pH試驗

用鹽酸和氫氧化鈉溶液調各培養基初始pH為5、6、7、8、9，觀察并記錄菌絲長勢。

1.5 數據分析

用Excel和SPSS 17.0對數據進行整理和分析。

2 結果與分析

2.1 病害癥狀

2020年3月對連云港市農業科學院試驗基地羊肚菌大棚調查發現，發病初期在子實體上出現白色小斑點，斑點逐漸擴大并穿孔，幼小的子實體被病原菌的白色菌絲覆蓋，最終停止生長(圖1中A和B)。

2.2 病原菌的分離純化及形態學鑒定

從發病羊肚菌樣品中，分離獲得致病菌JS-1。將致病菌菌餅覆蓋在羊肚菌菌帽部分，再置于培養皿中，3次重復，保濕培養若干天，直至有病斑形成，將病斑部位再進行分離培養，通過培養觀察菌落形態、顯微形態及ITS序列確定分離到的病原菌與發病菌株的致病菌為同一株病原菌。

在MYG培養基和25 ℃黑暗條件下，菌株JS-1的菌落初期為白色，輪狀生長，邊緣規則，菌絲絨毛狀，較發達，后期菌絲生長部位培養基萎縮(圖1中C)。分生孢子梗側生，分生孢子呈鏈式；分生孢子條形或梭形，有間隔(圖1中D)。

A—自然感病子實體；B—感病部位；C—病原菌在MYG平板25 ℃培養；D—病原菌顯微形態。圖1 病原菌形態特征

2.3 病原菌的分子生物學鑒定

經PCR擴增和序列測定，獲得供試菌株ITS序列片段，BLAST在線比對結果表明，JS-1與長毛擬青霉Paecilomycespenicillatus(登錄號：EU146306.1)相似度為99.81%；與長孢卵單隔孢霉Diplo?sporalongispora(登錄號：KX427537.1)相似度為99.44%。將致病菌的ITS序列與相近種菌株構建系統發育樹(圖2)，結果顯示，所得病原菌JS-1與長毛擬青霉菌株及長孢卵單隔孢霉聚于同一分支，說明其親緣關系較近。

2.4 病原菌生物學特性

致病菌菌絲在不同培養基下的生長情況見表1。在Czapek培養基上，致病菌菌絲生長速度最快，但中心菌絲濃密，邊緣菌絲稀疏；在MYG培養基上，菌絲生長速度較快，菌落邊緣整齊，菌絲濃密；其次為PDA培養基；SDAY培養基菌絲生長最為緩慢。在菌絲生長后期，可以觀察到培養基萎縮甚至穿孔。

致病菌菌絲在不同pH試驗結果見表2。羊肚菌致病菌菌絲在pH 5～9的條件下均可生長，pH 6～8時菌絲生長速度較快，且致病菌菌絲在不同pH下差異并不顯著。

致病菌菌絲在22～34 ℃溫度范圍下的生長情況見表3，在25 ℃條件下培養的實驗菌株菌絲生長速度最快，其次為22 ℃，溫度高于31 ℃時，菌絲不生長。因此，JS-1菌絲較適宜的生長溫度為25 ℃。

碳源試驗結果表明，致病菌株在不同碳源培養基上均能生長(表4)，但菌落形態及菌絲生長速率不同。在以乳糖為碳源的培養基上菌絲生長速率最快，為0.225 cm·d-1；其次為葡萄糖及淀粉，分別為0.205及0.201 cm·d-1。各培養基的菌絲密度差異較為顯著，其中淀粉為碳源時，菌絲生長最為濃密；以葡萄糖為碳源時，菌絲較為稀疏。因此，致病菌JS-1菌絲生長較適宜碳源為乳糖。

圖2 ITS序列系統發育樹

表1 培養基對菌絲生長的影響

表2 pH對菌絲生長的影響

表3 溫度對菌絲生長的影響

表4 碳源對菌絲生長的影響

氮源試驗結果表明，菌株在不同氮源培養基上均能生長，但氮源不同，菌絲體生長速度及菌落形態差異較大(表5)。在以酵母浸粉為氮源的培養基上，菌絲體生長速度最快，為0.312 cm·d-1，菌絲生長濃密。其次為以氯化銨為氮源的培養基，菌絲生長速度為0.222 cm·d-1，但菌絲生長稀疏。而在硫酸銨、磷酸氫二鉀為氮源的培養基上，菌絲體生長速度很慢，而且菌絲長勢差。因此，致病菌JS-1菌絲體較適宜的氮源為酵母浸粉。

表5 氮源對菌絲生長的影響

3 討論

近年來，羊肚菌因其低投入高回報的特點在全國范圍內種植面積大幅增加，對其致病菌進行研究，對保證其品質和產量有重要意義。目前，已有研究表明，多種病原菌可侵染羊肚菌子實體導致真菌病害發生。劉偉等[6]報道羊肚菌的真菌性病害主要有霉菌性枯萎病、蛛網病、鐮刀菌病。劉天海等[7]對四川等地暴發的柄腐病害進行調查鑒定，結合菌落形態和顯微特征鑒定柄腐病的病原菌為Fusariumnematophilum，該病原菌菌落正面白色，背面米白色，不透明，隆起，菌絲致密，邊緣整齊，菌落呈同心環紋，菌絲有隔，有分枝，無水溶性色素，分生孢子呈鐮刀型，整體較粗壯，中部略寬于兩端，尖端短而小，大多3隔，極少數1隔、2隔或4隔，呈3隔孢子的隔間距7～12 μm。余苗等[8]對羊肚菌白腐病病菇進行分離鑒定，采用形態學研究，結合ITS序列分析技術鑒定病原菌為曲霉(Aspergillussp.)，該病原真菌菌絲體顏色為白色，菌落邊緣整齊呈圓形，稍凸起，產生分生孢子后呈黃綠色，分生孢子球形、近球形。黃慧等[9]對貴州六盤水等地暴發的羊肚菌菌蓋干腐病進行病原菌的分離鑒定，結合形態學和分子生物學鑒定，發現病原菌為長孢卵單隔孢霉(D.longispora)，該致病菌菌落邊緣整齊、表面干燥，呈白色絨毛狀，有輪狀花紋，顯微形態下分生孢子梗透明，呈細長棍棒狀，分生孢子鏈生，呈棍棒狀或長檸檬形狀，有隔。

本研究分離得到的致病菌菌落初期為白色，輪狀生長，邊緣規則，菌絲絨毛狀，較發達，后期菌絲生長部位培養基萎縮，顯微形態下分生孢子梗側生，分生孢子鏈式；分生孢子條形或梭形，有間隔。測序獲得的ITS序列經NCBI比對后發現與長毛擬青霉相似度為99.81%；與長孢卵單隔孢霉相似度為99.44%，進一步構建系統發育樹表明JS-1的ITS序列與長毛擬青霉和長孢卵單隔孢霉聚為一支，這兩者均為羊肚菌真菌病害的主要病原菌[10-11]。前人研究[12-13]結果表明，這2種真菌的分生孢子都呈鏈式，但長毛擬青霉的分生孢子呈橢圓形或梨形，無隔；而長孢卵單隔孢霉的分生孢子為棍棒狀或長檸檬形，有隔。通過比對其形態學特征，本研究分離得到的致病菌在形態上更接近于長孢卵單隔孢霉。因此，通過結合發病特征、形態學觀察及構建分子系統發育樹表明該病害是由長孢卵單隔孢霉(D.longispora)侵染引起的。

此外，生物學特性研究結果表明，羊肚菌白霉病病菌最適生長溫度為25 ℃，30 ℃以上不生長，pH在6～9時生長較快，說明該菌不耐高溫，對pH適應范圍較廣，與黃慧等[9]的研究結果一致；最適碳、氮源為乳糖及酵母浸粉。本研究通過對羊肚菌白霉病病原菌的鑒定，尤其是對其進行系統的生物學特性研究，為進一步研究該病害的發病規律及田間防治奠定理論基礎。