八倍體草莓DNA指紋圖譜的構建與初步遺傳分析

劉國霞 張全芳 楊 雪 譚晴晴 胡 悅 范陽陽 姚 川 崔 剛 步 迅 陳雪燕* 劉炳福

(1.山東省農業科學院 農作物種質資源研究所，濟南 250100； 2.山東普朗特農業技術有限公司，濟南 250100； 3.山東省農業科學院 休閑農業研究所，濟南 250100)

草莓(FragariaananassaDuch.)是一種重要的經濟作物，因其獨特的風味和較高的營養價值素有“水果皇后”的美譽[1]。中國是世界上草莓主要生產國之一，2020年我國草莓栽培面積和產量分別為12.66萬hm2和332.68萬t，占世界種植面積和產量的32.92%和37.54%[2]。我國野生草莓資源豐富，自然分布的草莓屬植物約有13種，分別為二倍體和四倍體[3]，20世紀初八倍體的栽培草莓鳳梨草莓傳入我國[4]，目前為止已從國外引進八倍體草莓品種上百個，其中以日本品種和歐美品種居多[5]。近年來我國自主繁育的品種逐年增加，截至2017年，我國草莓育種單位育成品種112個[6]。由于我國草莓種植區分布廣泛，不同地區均存在引種現象，品種命名混亂，加上草莓本身的營養繁殖特性，同名異物或同物異名的現象時有出現[4]。因此，使用分子技術手段準確區分現有草莓品種資源很有必要。

利用分子標記技術構建DNA指紋圖譜，能夠從遺傳本質層面對品種進行鑒別和保護，中國已將利用DNA指紋圖譜輔助草莓新品種測試列為重要發展方向[7]。簡單重復序列標記(Simple sequence repeat，SSR)具有多態性豐富和穩定性好等特點，國內外學者開發了大量SSR標記用于草莓品種鑒定[4]、遺傳多樣性分析[8-9]及指紋圖譜構建[10-12]等研究。傳統SSR擴增產物需要經過銀染顯色等復雜工序，步驟繁瑣費時，而毛細管電泳熒光檢測方法具有操作簡便和靈敏度高的優勢，可克服這一難題。本研究擬利用最新SSR引物結合毛細管電泳技術對收集的84個八倍體草莓資源進行DNA指紋圖譜構建和遺傳分析，以期為草莓資源保護、品種鑒定和新品種選育提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料包括歐美、日韓及我國選育草莓品種，共計84份。現種植于山東普朗特農業技術有限公司，樣品信息見表1。

1.2 DNA提取與PCR反應

取草莓幼嫩葉片，加入液氮，用組織研磨儀研磨成粉末，采用天根植物基因組DNA提取試劑盒提取DNA。提取的DNA用適量TE緩沖液溶解，使用微量紫外分光光度計檢測DNA濃度和純度，置于-20 ℃保存。

參考苗立祥等[13]的研究方法，選用59對引物對部分樣品進行擴增。選擇條帶清晰、單一和擴增多態性較好的18對引物對所有樣品進行PCR擴增。上游引物連接M13引物序列，以便與熒光標記的M13引物進行互補配對。M13引物序列參考賈琳琳等[14]。普通引物和熒光引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

PCR反應體系總體積20 μL：10×Buffer 2.0 μL，2.5 mmol/L dNTPs 2 μL，5 U/μL Taq酶0.2 μL，10 μmol/L M13熒光引物1 μL，1 μmol/L上下游引物mix 1 μL，DNA模板2 μL，用去離子水補足20 μL。PCR反應程序：95 ℃模板預變性5 min，1個循環；95 ℃模板變性1 min，62 ℃～52 ℃每循環降低1 ℃，72 ℃引物延伸45 s，共10個循環；95 ℃模板變性1 min，52 ℃復性結合45 s，72 ℃引物延伸45 s，共25個循環；最后60 ℃延伸30 min，16 ℃保存。PCR結束后，取產物1～2 μL，加入含有ROX500內標的甲酰胺10 μL，95 ℃變性5 min，在ABI 3730XL DNA分析儀上進行熒光檢測。檢測結果通過GenemapperV4.0軟件進行片段大小和基因型分析。

表1 本研究所用的84份草莓資源信息Table 1 Information of 84 strawberry resources used in this study

1.3 數據分析

檢測產物明顯峰值按照四舍五入取整數記錄片段大小，將這些引物擴增主要片段帶型進行組合，即為品種的DNA指紋圖譜。將數據通過DataFormater2.7軟件轉換為NTSYS軟件要求的數據格式[15]。利用NTSYSpc 2.1軟件(http:∥www.appliedbiostat.com/) SM (Simple matching)法計算其遺傳相似系數，然后根據相似系數用SAHN Clustering和非加權成對算術平均法(Unweighted pair group method with arithmetic mean， UPGMA)進行聚類分析[12]。多態信息含量(Polymophism information content, PIC)為某一標記在群體中出現的頻率，反映該標記在群體檢測多態性的價值[16]。根據Nei[17]方法計算引物PIC值：PIC=1-ΣPi2，其中Pi為第i等位變異的頻率。

2 結果與分析

2.1 SSR引物篩選與多態性分析

選用DNA提取量較大，編號為9～15的7個草莓樣品對59個SSR引物進行篩選。經毛細管電泳檢測，選出18對多態性好和擴增信號強的引物，引物名分別為：S0011、S0051、S0061、S0121、S0181、S0231、S0291、S0301、S0331、S0341、S0351、S0471、S0491、S0611、S0641、S0701、S0791和S0971，這些引物分別編號P1～P18。每對引物擴增產物相對片段大小基本與此前苗立祥等[13]研究公布的一致(表2)。引物P10和P11在部分草莓品種中檢測的不同類型的等位變異峰見圖1。樣品‘紅太后’‘宮本7號’‘綏陵’‘胡得’經引物P10擴增得到的帶型組合分別為205、192/266、260/266和205/272，而‘賀登’‘新星2號’‘靜香’‘肇國’經引物P11擴增得到的帶型組合分別為200/223、197、195/250和223/250。

表2 擴增多態性信息所用18對引物Table 2 Polymorphic amplification information of the 18 primers used

圖1 引物P10(a)和P11(b)對部分草莓樣品擴增峰圖Fig.1 Amplified profiles of primer P10 (a) and P11 (b) from some strawberry samples

使用18對 SSR 熒光標記引物對84份草莓品種進行擴增，共得到156個條帶。其中多態性條帶150個，不同引物擴增到的多態性條帶數為4～17個，多態性條帶帶型總數為377個。采用遺傳多樣性分析各引物的PIC值范圍為0.494～0.908，平均值為0.738(表2)。說明這些引物多態性較高，可用于對這些草莓品種進行多態性分析。

2.2 84個草莓品種DNA指紋數據庫的建立

為便于記錄，將18對SSR引物P1～P18分別編號為A～R，每對引物在84個草莓品種中擴增出的帶型，按照條帶的個數從少到多(條帶個數相同的按照分子量從小到大)排序，依次將不同的帶型標注為1、2、3、…，再將每個品種在18對引物上擴增帶型進行對應的數字編碼[18]，將引物編號與相應的帶型編碼進行組合得到該樣品在特定引物的擴增產物編碼，18對引物順序串聯這些編碼形成該品種的DNA指紋圖譜。如P1共擴增帶型數20個，按照以上原則進行編號分別為1：250，2：254，3：258，4：262，5：241/250，6：241/254，7：241/258，8：241/262，9：243/250，10：243/254，11：243/258，12：243/262，13：243/278，14：250/254，15：250/258，16：250/262，17：254/258，18：254/262，19：258/262，20：258/266。例如：1號樣品‘小桃紅’由P1擴增到多態性帶型為250/254，對應第14種帶型，因此引物P1對‘小桃紅’擴增帶型編碼為A14；引物P2共擴增帶型數24個，該引物擴增‘小桃紅’的帶型為176/185/188/197，對應第17種帶型，則引物P2對‘小桃紅’擴增帶型編碼為B17。按照同樣原則，將其他引物對‘小桃紅’的擴增帶型進行編碼，按照P1～P18引物順序將帶型編碼進行組合，得到‘小桃紅’的指紋代碼為A14B17C25D5E10F4G15H8I17 J1K7L18M7N35O14P12Q6R1。按照此方法建立了84個草莓品種的DNA指紋圖譜數據庫。

2.3 聚類分析

基于18對SSR引物對84份草莓品種進行聚類分析(圖2)表明，84份草莓品種資源的遺傳相似系數范圍為0.61～0.99，一些品種之間相似系數接近0.99，如‘紅富美’‘紅珍珠’、‘福特拉米’‘紅太后’和‘胡得’‘格林1號’。聚類結果顯示一些來源接近的品種聚在一起，如紅花草莓‘小桃紅’‘粉佳人’，我國的地方品種‘丹東大果’‘石頭河子’聚在一起，‘荷蘭西峽’‘荷蘭草莓’聚在一起。在遺傳相似系數為0.74處可把供試品種劃分為4個主要類群。第I類有7個品種，歐美3個、我國3個和日本1個；第II類有17個品種，以歐美品種為主(12個)，還包括廣泛用作育種親本的日本‘紅顏’草莓以及我國培育的‘京怡香’草莓，‘紅顏’是‘京怡香’的親本之一；第Ⅲ類包括11個品種，其中歐美品種有6個，‘紅富美’‘紅珍珠’‘加拿大四季’聚在一起，歐美品種‘西5’‘賀登’和日本品種‘宮本7號’聚在一起，推測這些草莓可能具有較近的親緣關系；第Ⅳ類共49個品種，其中歐美品種17個，我國品種22個，日本和韓國品種共10個，包括市場主栽草莓品種‘甜查理’‘紅袖添香’‘妙七’‘香野’等。我國地方品種‘丹東大果’‘石頭河子’與我國選育品種遺傳距離較遠。

圖中序號對應的草莓品種詳見表1。I～IV表示在遺傳相似系數0.74處84個草莓品種所聚類成的4個類群。 SeeTable 1 for the detailed strawberry information corresponding to the code number in theFig.2. I～IV represents 4 groups of 84 strawberry samples clustered at genetic similarity coefficient 0.74. 圖2 基于18對SSR標記的84個草莓品種聚類分析樹狀圖Fig.2 Dendrogram of 84 strawberry based on 18 SSR markers

3 討論與結論

經過不同渠道引進國外草莓資源以及各地頻繁引種，導致我國草莓名稱容易出現同物異名或同名異物等現象。如本研究中的草莓品種‘都卡’疑似為荷蘭品種‘因都卡’(Induka)，草莓品種‘紅崗特利德’(Red gauntled)有研究稱為‘紅崗利特德’[21]或稱為‘紅手套’[8]。因此，對于國外引進品種有必要規范品種名稱，建議從國外引進的品種可直接記錄英文名稱，避免出現命名混亂的情況。另外，對于品種名稱不確定的資源，可以通過建立DNA指紋圖譜來區分不同品種。本研究構建了84個草莓品種的DNA指紋信息數據庫，為這些草莓品種準確區分提供了方法。

本研究所用的SSR引物選自苗立祥等[13]基于草莓基因組序列開發的，從中篩選出的18對引物多態性較好，對84個草莓品種擴增條帶數和片段范圍與苗立祥等[13]報道的有些差異，其原因除了苗立祥等[13]引物直接標記熒光而本研究使用M13熒光引物之外，還可能跟所用試驗材料不同有關。許多研究者應用熒光SSR標記的毛細管電泳技術檢測的方法構建了小麥[18]、高粱[19]和水稻[20]等作物的指紋圖譜，黃志城等[12]參照小麥指紋編碼方法，按照固定引物順序，串聯各帶型編碼，形成1組代表該品種的數字信息，構建了中國草莓已知品種DNA指紋信息數據庫。本研究參考前人的方法對每對引物擴增草莓樣品的帶型進行編碼，但與前人研究的區別在于之前研究中帶型編碼以數字1～9和英文A～Z(記錄10以上的帶型)表示，所以指紋信息中每一位數字或字母代表每個引物的擴增帶型信息，如第2位數字或字母代表第2個引物擴增的帶型特征；而本研究中僅以數字記錄帶型，首次將引物進行編號，引物編號與相應的帶型編碼進行組合得到該樣品在特定引物的擴增產物編碼，按照18對引物順序串聯這些編碼形成該品種的DNA指紋圖譜。與前人指紋圖譜編碼方法相比，本研究采用的編碼加入引物編號，使編碼更方便，不易出錯。

本研究基于18對SSR引物建立了84份草莓品種資源的遺傳關系，品種間遺傳相似系數范圍為0.61～0.99，與韓柏明等[21]利用18對SSR引物研究96份草莓資源的相似系數在0.62～1.00的研究一致。說明現有草莓品種之間親緣關系較近，可能與常規雜交選育新品種的方式有關。本研究中聚類分析發現，我國選育的品種與國外品種混雜在一起，其可能原因是我國選育品種和地方品種及日本品種都直接或間接來源于歐美品種[21]，導致遺傳基礎狹窄。因此今后我國草莓育種應收集利用更多種質資源，尤其是野生資源，拓寬草莓品種遺傳基礎，為培育出優質的草莓新品種奠定基礎。