檸檬色百合實時熒光定量PCR內參基因篩選

梁 蕤 徐雷鋒 畢蒙蒙 王 靜 唐玉超 郝澤慧,4 劉一潔,5 楊盼盼 明 軍* 杜 方

(1.山西農業大學 園藝學院，山西 太谷 030801； 2.山西農業大學 城鄉建設學院，山西 太谷 030801； 3.中國農業科學院 蔬菜花卉研究所，北京 100081； 4.北京農學院 園林學院，北京 102206； 5.青島農業大學 園林與林學院，山東 青島 266109)

花色是觀賞園藝植物最重要的觀賞性狀之一，其主要由類黃酮、類胡蘿卜素、甜菜色素和葉綠素這4大類化合物構成，其中，類黃酮和類胡蘿卜素是百合花色的主要呈色物質[1]。相比于類黃酮代謝研究，類胡蘿卜素代謝研究較少[2-3]，且類胡蘿卜素代謝更為復雜。類胡蘿卜素既作為色素在花和果實中積累呈色，也參與光合作用，參與植物生長發育和調控激素水平[4]。產自日本的檸檬色百合(Liliumleichtlinii)屬于百合科百合屬，其花被片背景富含類胡蘿卜素呈檸檬黃色，花1～5朵下垂，開放時花被片向上反卷，具有極高的觀賞價值，是研究百合類胡蘿卜素花色呈色機理的優選材料[5]。

在以檸檬色百合為試驗材料揭示百合類胡蘿卜素分子調控機理的過程中，檢測類胡蘿卜素代謝關鍵基因表達是必不可少的環節。常規檢測基因表達的方法有Northern雜交(Northern blotting)、半定量RT-PCR(Semi-quantitative reverse transcription polymerase chain reaction)、實時熒光定量PCR(Reverse transcription real-time polymerase chain reaction， qRT-PCR)、微陣列分析(Microarrays analysis)、轉錄組測序(RNA sequencing)和原位雜交(In situ hybridization， ISH)等[6-7]。其中qRT-PCR技術憑借其高準確度、高靈敏度、高通量和操作方便等優點被廣泛應用[8]，該技術支持絕對定量分析和相對定量分析。絕對定量常用來探究單個樣品的本質屬性，相對定量常用來比較多個樣本間某一特定性質[6,9]。試驗中通常運用相對定量探究不同樣本間同一基因表達情況。相對定量分析的準確性受到RNA質量和完整性、反轉錄效率和擴增效率等因素的影響[10]。因此，需要使用1個或多個穩定內參基因(Reference genes)對目的基因的表達進行均一化[11-13]。

內參基因指的是在各個樣品中表達恒定的基因[14]，其穩定性和可靠性直接關系到目的基因表達檢測結果的準確性和整體試驗研究的可靠性。在不同百合種(品種)、花發育過程、花被片不同部位、不同器官及不同處理下，大多使用Actin或GAPDH(Glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase)作為內參基因[15-20]；在研究百合體細胞胚的生長發育過程時也用到FP(F-boxfamilyprotein)作為內參基因[21]。但幾種常用內參基因在百合不同組織器官間、花發育過程、花遮光處理及葉、鱗片和根脅迫處理中的穩定性是可能變化的。因此，具體百合種(品種)及研究條件下仍需重新篩選穩定適宜的內參基因[22-23]。

本研究根據前期建立的轉錄組數據庫和已報道的百合內參基因，選取了9個候選內參基因，使用geNorm、NormFinder、ΔCT、Bestkeeper程序和RefFinder網站比較分析這9個候選內參基因在檸檬色百合花被片發育過程和不同器官間的表達情況，并對候選內參基因穩定性進行評估排序。為檢驗內參基因評估的準確性，本研究以篩選出最穩定的內參基因和最不穩定的內參基因作為參照，檢測了八氫番茄紅素酶基因PSY(Phytoenesynthase)表達情況。PSY作為類胡蘿卜素代謝途徑的第1個限速酶，在植物花、葉、果實和根等不同器官中PSY基因表達的情況直接決定總類胡蘿卜素含量的積累[16,24-27]。因此，本試驗將PSY基因在檸檬色百合花被片發育過程和不同器官間表達情況與對應的總類胡蘿卜素含量變化趨勢結合，用來驗證候選內參基因的穩定性。本研究旨在綜合多個程序網站評估候選內參基因穩定性，通過檢測總類胡蘿卜素積累和PSY基因表達驗證內參基因穩定性，最終確定檸檬色百合花被片發育過程和不同器官間適宜穩定的內參基因，以期為百合類胡蘿卜素的研究提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以檸檬色百合(L.leichtlinii)為試驗材料，種植于中國農業科學院蔬菜花卉研究所資源圃內。依照花蕾顏色變化和花被片發育2項指標進行取材。花被片發育第1時期(S1)：花色轉變前期，花蕾長約5.5 cm，整體呈綠色，取其綠偏黃色內花被片作為試材；花被片發育第2時期(S2)：花開放前一天，花蕾整體柔軟、不緊實，呈鮮艷檸檬黃色，花蕾中部膨大，有張開趨勢，取其檸檬黃色內花被片作為試材；花被片發育第3時期(S3)：花開放當天，花被片向上反卷，取其反卷的檸檬黃色內花被片作為試材(圖1(a)～(c))。同時，取開放當天內花被片、葉、莖、鱗片和根作為不同器官試驗材料(圖1(d)～(h))。每個樣品設3個生物學重復，樣品經液氮速凍后存于-80 ℃超低溫冰箱備用。

(a)第1時期，花色轉變前期；(b)第2時期，花開放前一天；(c)第3時期，花開放當天；(d)花；(e)葉；(f)莖；(g)外層鱗片；(h)根。標尺=2 cm。(a) Stage 1， early phase of color transition； (b) Stage 2，the day before anthesis； (c) Stage 3， 0 day post-anthesis； (d) Flower； (e) Leaf； (f) Stem； (g) The outer scale； (h) Root. Scale=2 cm.圖1 檸檬色百合不同發育時期的花和不同器官Fig.1 Flowers in different developmental stages and different tissues of Lilium leichtlinii

1.2 總類胡蘿卜素含量測定

將超低溫保存的檸檬色百合內花被片、葉、莖、鱗片和根樣品冷凍干燥后用研磨儀研磨，稱取0.015 g干樣溶于1 mL提取液(V(正己烷)∶V(丙酮)∶V(乙醇)=2∶1∶1)，包含質量濃度為0.01%的2,6-二叔丁基對甲酚(BHT))中，渦旋30 s，置于25 ℃超聲波清洗儀振蕩20 min；之后4 ℃離心5 min(12 000 r/min)，收集上清避光保存。對沉淀重復上述步驟，收集上清，用提取液定容至5 mL，用0.22 μm有機濾膜過濾后，取3 mL于紫外分光光度計440、645和663 nm波長下檢測吸光值，每個樣品3個生物學重復[28]?？傤惡}卜素含量根據莫玉楠等[29]的方法進行計算。

1.3 候選內參基因選擇及引物序列

文獻檢索分析Li等[22]和Xu等[23]合成的百合內參基因引物：AP-4complexsubunit(AP4)(NCBI登錄號：KP861878)、Beta-tubulin1(β-TUB)(NCBI登錄號：KP861875)、Cyclophilin(CYP)、Eukaryoticinitiationfactor1(eIF)(NCBI登錄號：KP861874)、Glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase1(GAPDH)(NCBI登錄號：KP179417.1)、DEADboxRNAhelicase(RH2)(NCBI登錄號：KP861880)和18SRibosomalRNA(18S)(NCBI登錄號：AY684927.1)。同時在已有檸檬色百合轉錄組數據庫中對所有Unigene不同樣本的fpkm值進行標準差分析，在fpkm值高且標準差小的Unigene中搜索常用內參基因，最終篩選出Actin2(Actin)(NCBI登錄號：OP539310)和Ubiquitin-conjugatingenzymeE22(UBC)(NCBI登錄號：OP539311)2個常用內參基因，所有內參基因引物序列如表1所示。PSY引物序列參照Wang等[16]的設計(F：CCAGAGTCCC-GTGCATCGAC；R：ATATCGTCCTCTGAAAG-GCC)。引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。

表1 候選內參基因qRT-PCR的引物序列和擴增參數Table 1 Primer sequences and amplification parameters for candidate reference genes

1.4 總RNA提取和cDNA第1鏈合成

使用RNAprep Pure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒(天根生化有限公司)提取檸檬色百合內花被片、葉、莖、鱗片和根的RNA，并將不同樣本的RNA均稀釋為相同濃度(110.0 ng/μL)，使用Hifair?II 1 st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR(gDNA digester plus)(翊圣生物科技股份有限公司)進行反轉錄，用EASY Dilution(for Real Time PCR)(Takara)進行cDNA稀釋。為檢測引物擴增效率，將葉的cDNA原液依次稀釋5倍并設置5個濃度梯度，分別為葉cDNA原液的5-1、5-2、5-3、5-4和5-5倍。將不同樣本cDNA原液稀釋5倍使用，每個樣本均為3個生物學重復。

1.5 候選內參基因RT-PCR擴增和qRT-PCR反應

以檸檬色百合葉cDNA為模板，進行RT-PCR擴增。擴增體系為：總體積10.0 μL，其中2×Taq PCR MasterMix 5.0 μL，primer-F(10 μM)0.5 μL，primer-R(10 μM)0.5 μL，cDNA 1.0 μL，ddH2O 3.0 μL。反應條件為：94 ℃初始變性5 min，94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s；72 ℃延伸20 s，35個循環，72 ℃最后延伸10 min。得到的PCR產物經2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，在BIO-RAD凝膠成像儀觀察拍照。

以檸檬色百合葉5個濃度梯度的cDNA及不同樣本cDNA為模板，在BIO-RAD CFX96實時熒光定量PCR儀中對不同內參基因及PSY基因進行三步法熒光定量。擴增體系：總體積20.0 μL，其中qPCR SYBR?Green Master Mix 10.0 μL，primer-F(10 μM)0.4 μL， primer-R(10 μM)0.4 μL，cDNA 2.0 μL，ddH2O 7.2 μL。反應條件為：95 ℃預變性5 min，95 ℃變性10 s，56 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，40個循環。熔解曲線程序為：65 ℃～95 ℃每5 s升溫0.5 ℃。

反應結束后由CFX Manager軟件生成熔解曲線，根據熔解曲線分析候選內參基因引物特異性。根據各內參基因在不同檸檬色百合葉cDNA梯度下CT值繪制標準曲線并計算斜率(k)、擴增效率(E)和線性相關系數(R2)，利用CFX Manager軟件Gene Study程序中Pfaffl方法計算基于單個內參基因的PSY相對表達量，運用Vandesomple方法計算基于多個內參基因的PSY相對表達量，使用SPSS分析PSY相對表達情況與總類胡蘿卜素積累間斯皮爾曼相關性。

1.6 數據分析及候選內參基因穩定性評價

整理全部樣本中候選內參基因CT值，使用geNorm、NormFinder、ΔCT、Bestkeeper 程序和RefFinder網站(https:∥www.heartcure.com.au/reffinder/?type=reference)分析檸檬色百合花被片發育過程和不同器官間候選內參基因的表達穩定性。

geNorm程序將循環數轉換為基因相對表達量，即將所有CT值轉換為2ΔCT(ΔCT=各CT值-最小CT值)，通過計算候選內參基因表達穩定值(M)來評估。M值與穩定性呈負相關，M值越小，穩定性越高，若M值超過1.5即認定該基因不適合作內參基因。之后計算出標準化所需的最佳內參基因數量，程序默認值為Vn/(n+1)=0.15，當Vn/(n+)<0.15，選擇n個內參基因用于標準化[30]。

NormFinder與geNorm相似，根據表達穩定值進行穩定性排序，但只能選出1個穩定內參基因[31]。

ΔCT方法是比較成對基因在不同樣本中ΔCT值，若在所有樣本中這2個基因ΔCT值保持不變，則認為這2個基因在這些樣本中穩定表達；若ΔCT變化，則表明其中1個基因或2個基因都表達不穩定。如此計算，最終根據結果進行穩定性排序[32]。

Bestkeeper程序首先根據標準偏差(SD)和變異系數(CV)對內參基因表達穩定性進行評估，從低到高依次進行穩定性排序。其中SD>1即視為不穩定內參基因，同時將所有輸入候選內參基因組成1個Bestkeeper指數，計算每個候選內參基因和Bestkeeper指數之間的相關性，通過皮爾遜相關系數(r)、決定系數(r2)和顯著水平P值(P)描述候選內參基因與Bestkeeper指數之間的關系[14]。

最后依托RefFinder在線網站基于以上4個程序結果，給每個候選內參基因分配1個適當權重，并計算它們權重的幾何平均值，以獲得最終的整體排名[33]。

2 結果與分析

2.1 總類胡蘿卜素含量

在檸檬色百合花被片中，隨著生長發育，花被片背景顏色由綠變黃，積累的總類胡蘿卜素含量增加(圖2(a))；檸檬色百合葉子為綠色，莖和鱗片表面附著淺紫色，根為乳白色，總類胡蘿卜素在不同器官間積累依次為：花被片>葉>莖>根>鱗片，且根和鱗片中含量極少(圖2(b))。

2.2 引物特異性及擴增效率

以檸檬色百合葉cDNA為模板，用9個候選內參基因的引物進行RT-PCR擴增，電泳圖顯示片段大小正確，條帶單一，均無引物二聚體(圖3(a))。以5個濃度梯度的檸檬色百合葉cDNA 為模板，進行qRT-PCR反應，結果顯示，熔解曲線均為單一信號峰，且同一樣品重復性好，表明9個候選內參基因引物特異性高(圖3(b)～(j))。根據qRT-PCR反應所得CT值繪制標準曲線，9個候選內參基因的相關系數R2介于0.988 4～0.997 0之間，擴增效率介于91.02%～102.98%之間(表1)。

同一圖中不同字母表示差異顯著(P<0.050)，相同字母表示差異不顯著(P>0.050)。 Within the same graph, different letters represent significant differences (P<0.050)， while the same letters represent no significant differences (P>0.050).圖2 總類胡蘿卜素含量Fig.2 Total carotenoid content

2.3 表達水平分析

利用所有樣本中得到的CT值可以預測9個候選內參基因的表達水平。CT值越低，表達豐度越高，9個候選內參基因在花被片發育過程和不同器官間的CT值分布見圖4。結果表明：18S表達豐度最高，eIF和UBC的表達水平變異最小。

2.4 穩定性分析

將geNorm和NormFinder結果按照M值排序，ΔCT結果按照平均標準偏差排序。Bestkeeper結果中，按SD從小到大、CV從低到高依次進行穩定性排序，同時考慮候選內參基因與Bestkeeper指數間r和P值。若2個內參基因間SD值相近、CV值也相近，則將r值低的內參基因排在后面；若候選內參基因SD>1則視為不穩定內參基因，候選內參基因與Bestkeeper指數間P>0.05也視為不穩定內參基因(表2)。

由于不同程序算法不同，所得結果并不一致，用RefFinder網站對上述程序結果進行綜合分析確定最終內參基因穩定性排序。

2.4.1檸檬色百合花被片發育過程中候選內參基因穩定性分析

檸檬色百合花被片發育過程所得Bestkeeper結果中，雖然UBC的SD最小，CV最低，但其與相應Bestkeeper指數相關系數的P值為0.507，遠大于0.050，表明UBC與Bestkeeper指數不相關；而其余8個候選內參基因與Bestkeeper指數相關系數的P值均為0.001，r值在0.876～0.996之間，表明這8個候選內參基因與Bestkeeper指數間相關性強且呈極顯著相關。說明在檸檬色百合花被片發育過程中，UBC與其它候選基因存在較大差異，不適合作內參基因。CYP的SD值>1.00，為不穩定內參基因(表2)。

geNorm計算最穩定的內參基因為AP4和β-TUB(圖5(a))，NormFinder計算最穩定的內參基因為β-TUB(圖5(c))，ΔCT計算最穩定的內參基因為Actin(圖5(d))，Bestkeeper計算最穩定的內參基因為eIF(表2)，綜合以上4個程序的結果判斷最不穩定的內參基因為UBC。geNorm程序默認Vn/(n+1)=0.15，檸檬色百合花被片發育過程中計算得V2/3配對變異系數為0.06，小于0.15，故檸檬色百合花被片發育過程中熒光定量標準化所需的最佳內參基因數為2(圖5(b))。RefFinder綜合以上4個程序分析結果，計算得檸檬色百合花被片發育過程最穩定的內參基因為Actin和AP4(表3)。

2.4.2檸檬色百合不同器官間候選內參基因穩定性分析

檸檬色百合不同器官間所得Bestkeeper計算結果中，9個候選基因與相應Bestkeeper指數間顯著相關。β-TUB和18S的SD>1.00，為不穩定內參基因(表2)。geNorm計算最穩定的內參基因為AP4和Actin(圖6(a))，NormFinder和ΔCT計算最穩定的內參基因為eIF(圖6(c)和(d))，Bestkeeper計算最穩定的內參基因為AP4(表2)。geNorm程序計算的V2/3配對變異系數為0.15，故至少需要2個內參基因用于檸檬色百合不同器官間標準化(圖6(b))。根據RefFinder綜合分析，計算得檸檬色百合不同器官間最穩定的內參基因為eIF和AP4，最不穩定的內參基因為18S(表3)。

RFU：相對熒光定量值。RFU: Relative fluorescence units.圖3 候選內參基因引物特異性Fig.3 Amplification specificity of primers

中間橫線表示中位數。 The middle horizontal line is the median.圖4 9個候選內參基因的CT值分布圖Fig.4 Distribution of CT values of candidate reference genes in all samples

表2 Bestkeeper分析候選內參基因穩定性Table 2 Expression stability values of candidate reference genes calculated by Bestkeeper

將以上程序和網站計算的9個候選內參基因在檸檬色百合花被片發育過程與不同器官間表達穩定性由高到低排序(表3)。

2.5 檢測PSY基因表達驗證內參基因穩定性

在檸檬色百合花被片發育過程中，以穩定的Actin和AP4分別或共同作為內參基因對PSY基因相對表達量進行計算(圖7(a)～(c))。結果表明，隨著花被片發育，PSY基因表達逐漸升高，變化趨勢和總類胡蘿卜素含量變化趨勢一致。而以最不穩定的UBC作為內參基因計算時，在S1中，PSY基因表達最高且S3中PSY表達最低，與以Actin和AP4作為內參基因計算的結果相反(圖7(d))。該結果再次證實檸檬色百合花被片發育過程中UBC不適合作為內參基因。

圖5 不同程序分析花被片發育過程中候選內參基因穩定性Fig.5 Expression stability values of candidate reference genes analyzed by different applications in tepals at different developmental stages

在檸檬色百合不同器官間，以表達穩定的eIF和AP4單獨或共同作為內參基因對PSY基因進行相對表達量計算(圖7(e)～(g))。結果顯示，PSY基因表達的總體趨勢與總類胡蘿卜素積累的趨勢相同，表達情況由高到低依次為花被片、葉、莖、根和鱗片。用最不穩定的18S作為內參基因進行計算，PSY表達情況與總類胡蘿卜素積累趨勢有所不同，表達量由高到低依次為花被片、莖、葉、根和鱗片(圖7(h))。

同時，利用SPSS做PSY基因表達與總類胡蘿卜素含量斯皮爾曼相關性分析(表4)。結果顯示，在檸檬色百合花被片發育過程中，以Actin和AP4單獨或綜合作為內參基因計算所得PSY基因表達情況與總類胡蘿卜素含量呈極顯著正相關，以UBC為內參基因計算所得PSY基因表達情況與總類胡蘿卜素含量呈極顯著負相關。在檸檬色百合不同器官間，以eIF和AP4單獨或綜合作為內參基因計算所得PSY基因表達與總類胡蘿卜素含量呈極顯著正相關，以18S為內參基因計算所得PSY基因表達情況與總類胡蘿卜素含量呈顯著正相關。

3 討 論

3.1 使用穩定表達內參基因是獲得準確基因表達結果的關鍵

在花被片發育過程中，‘Tiny Padhye’百合中TIP41和Actin穩定性高[23]，而本研究檸檬色百合中，Actin和AP4穩定性高；在不同器官和組織間，Liliumdavidiivar.unicolor中Actin、GAPDH和UBQ穩定性高[22]，‘Tiny Padhye’中Actin、Actin11和EF1-α穩定性高[23]，本研究中檸檬色百合eIF和AP4穩定性高。由此可見，不同品種的百合在相同試驗條件下的最佳穩定內參基因有所不同。

圖6 不同程序分析不同器官間候選內參基因穩定性Fig.6 Expression stability values of candidate reference genes analyzed by different applications in different tissues

本研究為驗證候選內參基因評估結果的準確性，不僅基于穩定的內參基因探究PSY表達情況，同時也基于不穩定的內參基因對PSY表達進行計算。結果表明，無論是在檸檬色百合花被片發育過程中還是不同器官間，單獨使用穩定性差的內參基因會導致結果不準確。在檸檬色百合花被片發育過程中，使用穩定性差的UBC作為內參基因計算所得結果與使用穩定性高的內參基因Actin和AP4計算結果相反；在不同器官間使用穩定性差的18S作為內參基因計算時，莖中PSY表達高于葉中，與實際情況相反。因此，在進行基因表達分析時，為了得到準確結果需要先進行穩定內參基因的篩選。

3.2 內參基因穩定性評估需綜合多個方法分析并進行試驗驗證

在進行內參基因穩定性評估時，不同程序得到的結果并不相同，這是因為不同程序基于不同的算法和假設。geNorm程序建立在候選內參基因間無共表達的條件下展開，計算每一個候選內參基因與其他候選內參基因兩兩間變異系數，將這些變異系數的平均值定義為該基因的表達穩定值[30]；NormFinder是結合組內方差與組間方差計算候選內參基因的穩定值[31]；ΔCT方法將所有候選內參基因兩兩組對為“基因對”，比較“基因對”在不同樣本間的相對表達[32]；Bestkeeper程序是對每個候選內參基因在所有樣本中的CT值進行描述性統計,同時也將所有候選內參基因綜合為1個Bestkeeper指數，計算每個候選內參基因與該指數之間相關性[14]。為了解決以上不同程序所得結果差異的問題，Xie等[33]將這4種分析方法整合成1個網絡分析工具RefFinder，對以上4個程序的結果進行綜合評價。本研究使用geNorm、NormFinder、ΔCT和Bestkeeper程序分別對候選內參基因穩定性進行評估，并最終使用RefFinder網站對以上4個程序結果進行了綜合分析，確定了檸檬色百合花被片發育過程及不同器官間qRT-PCR穩定內參基因。

(a)～(d)PSY基因在花被片發育過程中表達情況；(e)～(h)PSY基因在不同器官間表達情況。(a) to (d) The expression of PSY in tepals at different developmental stages； (e) to (h) The expression of PSY in different tissues.圖7 PSY基因相對表達量Fig.7 Relative expression patterns of PSY

表4 PSY基因相對表達與總類胡蘿卜素含量之間斯皮爾曼相關性Table 4 The spearman correlation coefficient of PSY relative expression patterns and carotenoid content

上述程序中，geNorm與Bestkeeper均倡導多內參基因策略，以此減少因某內參基因使用不當所造成的誤差，使計算的目的基因表達模式更接近真實水平。本研究以geNorm計算的所需內參基因數量為準，在檸檬色百合花被片發育過程及不同器官間均使用最穩定的2個候選內參基因對PSY基因相對表達量進行計算。

前人在使用Bestkeeper程序對候選內參基因進行穩定性評估時，常常默認以SD為主CV為輔進行穩定性排名，并沒有考慮Bestkeeper指數含義，沒有顧及到候選內參基因與Bestkeeper指數間的關系[34]。本研究在計算檸檬色百合花發育過程中9個候選基因穩定性時，雖然UBC的SD最小，CV最低，按照已有研究中常用的方法應該將其認定為該條件下最穩定的內參基因。但研究發現，UBC與相應Bestkeeper指數相關系數的P值遠大于0.050，無相關性，其余8個候選內參基因與該指數相關系數的P值均為0.001，r值在0.876～0.996之間，表明這8個候選內參基因與該指數間相關性強且相關性顯著。因此，在檸檬色百合花發育過程中UBC并不適合作內參基因。此外，以UBC作為內參基因，用Pfaffl方法計算檸檬色百合花被片發育過程中PSY基因表達量由高到低依次為：S1>S2>S3，與其真實表達趨勢相反，進一步佐證了UBC的不穩定性。同時也說明不正確使用和分析Bestkeeper程序輸出信息，會影響對候選內參基因穩定性的判斷。

4 結 論

本研究選用9個候選內參基因，研究其在檸檬色百合花被片發育過程及不同器官間的表達情況，通過不同程序和網站計算穩定性排序及驗證試驗，最終確定，進行熒光定量PCR試驗時，在檸檬色百合花被片發育過程中檢測目的基因表達情況需使用Actin和AP4作為內參基因；而在檸檬色百合不同器官間檢測目的基因表達情況需使用eIF和AP4作為內參基因。如此才能夠既穩定又正確地反映目的基因表達量。