m6A修飾在骨肉瘤中分子機制的研究進展*

凌志安，梁玉婷，韋素萍，王 禹，趙勁民**

(1.廣西醫科大學第二附屬醫院，廣西南寧 530007；2.廣西醫科大學，廣西南寧 530021)

骨肉瘤(Osteosarcoma，OS)是骨骼系統中最常見的原發性惡性腫瘤之一，起源于間葉組織，好發于兒童和青少年，具有高侵襲性與轉移性且進展迅速，早期易發生肺轉移，嚴重危害患者的生命健康[1,2]。N6-甲基腺苷(m6A)是真核生物中編碼和非編碼RNA中最廣泛的RNA修飾形式之一。現有研究表明，m6A相關因子在骨肉瘤進程中發生了失調，且與骨肉瘤發生發展密切相關[3]。本文強調了m6A修飾在骨肉瘤發生發展與預后轉歸中的關系，闡述了其細胞生物學功能和分子機制，以及未來在骨肉瘤中的研究趨勢和潛在的臨床應用，為臨床提供新的檢測指標和治療靶點。

1 m6A修飾

N6-甲基腺苷(m6A)是發生在腺苷N6位點的甲基化修飾，是真核生物mRNA中最普遍的內部修飾。m6A修飾是指在腺嘌呤核苷酸的第6位氮原子上添加或刪除甲基，是mRNA分子中最豐富的表觀遺傳修飾之一[4]。有研究發現，m6A修飾是一種具有動態和可逆特征的表觀遺傳學改變[5]，可以通過多種調節蛋白來調節RNA的剪接、核輸出、定位、翻譯、降解和穩定性。一些研究報道了m6A修飾在人類不同腫瘤發生發展中的作用以及與細胞分化、胚胎發育、疾病發生有關的細胞生物學功能[6,7]。Zhang等[8]研究發現，與正常組織/成骨細胞相比，在骨肉瘤組織/細胞中DLGAP1-AS2和m6A甲基化水平上調，通過進一步構建風險評分預后模型，預測DLGAP1-AS2可能成為OS的預后靶向基因。

2 m6A甲基化蛋白酶

m6A修飾主要與3種類型的蛋白酶相關，即為多酶復合體，主要包括甲基化轉移酶(稱為“編碼器”)、去甲基化轉移酶(稱為“消碼器”)和甲基識別蛋白(稱為“讀碼器”)[6]，三者之間存在復雜的生物學功能[9]。

第一類是m6A甲基化轉移酶，其編碼基因稱為“Writers”，包括METTL3、METTL14、WTAP、RBM15B、KIAA1429、ZC3H13和METTL16。METTL14與METTL3形成的穩定復合物促使m6A甲基化基團編輯入RNA中[10]，在底物識別中起主要作用[11-13]。每種蛋白其生物學功能各不相同，METTL3的結構域具有催化活性，METTL14與METTL3形成異源二聚體，協同增強甲基轉移酶活性[13]。WTAP被認為是一種銜接蛋白，主要功能是和METTL3-METTL14復合物相互結合，起穩定METTL3-METTL14復合物的作用[11]。RBM15B主要功能是與尿嘧啶富集區域結合，促進某些RNAs的甲基化[14]。ZC3H13主要在錨定WTAP中起著關鍵作用，通過將WTAP連接到mRNA結合因子Nito來增強m6A活性[15,16]。ZC3H13參與了不同類型腫瘤的發生發展過程。據報道，ZC3H13在腎透明細胞癌組織中的表達顯著下調[17]，相反，與鄰近黏膜相比，ZC3H13在結腸腺癌腫瘤組織中的表達顯著上調[18]。此外，METTL16是最近發現的一個甲基化轉移酶，能催化U6-snRNA中的m6A修飾，并參與rRNA的剪接[19]。KIAA1429是m6A甲基化酶復合物中重要的一部分，但其分子功能仍難以捉摸[20]。總之，每一個m6A甲基化轉移酶對于m6A修飾是必需的，m6A甲基化轉移酶和m6A去甲基化轉移酶之間的相互作用決定了m6A修飾的動態和可逆調節。

第二類是m6A去甲基化轉移酶，其編碼基因稱為“Erasers”，目前報道的有FTO和ALKBH5[21]。這類去甲基化轉移酶可去除RNA中的m6A甲基化基團，從而影響腫瘤生物學過程。越來越多的研究表明，FTO和ALKBH5的功能障礙可能導致癌癥發生[22-25]。FTO在乳腺癌中表達上調，可促進乳腺癌細胞增殖，同時FTO在肝細胞癌(HCC)組織中的表達也上調，這與患者預后不良有關[26]。

第三類是甲基識別蛋白，其與m6A甲基化位點結合并讀取信息，進而發揮作用，其編碼基因稱為“Readers”，到目前為止發現的包括YTHDF1、YTHDF2、YTHDF3、YTHDC1、YTHDC2等YTH家族，還有HNRNPC、HNRNPG、HNRNPA2B1和IGF2BP[27]，這些基因在維持m6A的mRNA的穩定性、代謝以及翻譯等過程中發揮重要作用[28]。隨著蛋白質研究的不斷深入，甲基識別蛋白逐漸被發現，其功能與分子機制也在進一步完善。

3 m6A修飾在骨肉瘤中的分子作用機制

3.1 m6A修飾在骨肉瘤發生發展中的作用

OS的發病是一個多因素的復雜過程，涉及廣泛的分子異常和腫瘤異質性[29]。據報道，m6A是真核細胞中含量最豐富的RNA內部修飾，m6A修飾主要通過調節相關致癌基因或抑癌基因的mRNA水平來促進或抑制腫瘤細胞增殖、侵襲及遷移等，并且異常的m6A修飾可通過多個分子機制在腫瘤發生中起重要作用[30]。

目前，許多研究證實了m6A修飾調控因子對OS細胞生物學功能的影響。Yuan等[31]的研究發現，與正常成骨細胞/組織相比，骨肉瘤細胞/組織中去甲基化酶ALKBH5水平的下調與m6A甲基化水平升高有關，ALKBH5過表達可顯著抑制骨肉瘤細胞的生長、遷移、侵襲和觸發細胞凋亡；而沉默ALKBH5可促進骨肉瘤細胞生長、遷移和侵襲，該研究預示ALKBH5過表達可能是替代骨肉瘤治療的一種新方法。Chen等[32]與Huang等[33]的研究也得出類似的結論，ALKBH5通過介導PVT1的m6A修飾，抑制閱讀器蛋白YTHDF2在PVT1中的結合;ALKBH5介導的PVT1上調促進了體外OS細胞增殖和體內腫瘤生長;ALKBH5的過表達顯著抑制了OS細胞的生長、遷移和侵襲等細胞生物學效應。Shi等[34]利用circRNA芯片檢測骨肉瘤中circRNA表達的改變，結果發現骨肉瘤組織中circNRIP1的表達水平升高，通過下調circNRIP1表達水平可抑制骨肉瘤細胞的增殖和遷移，促進細胞的凋亡。Ling等[35]的研究表明，在OS細胞中敲除METTL3基因，導致m6A和DRG1 mRNA水平下降，沉默DRG1可降低OS細胞的活力，抑制細胞的遷移和集落形成能力，導致細胞周期阻滯在G2/M期，誘導細胞凋亡。由上述可知，DRG1在OS中具有致瘤作用，其中METTL3以m6A依賴的方式誘導DRG1在OS中的表達上調。Wang等[36]在轉移性骨肉瘤的研究中發現，METTL3與TRAF6呈正相關關系，METTL3下調會導致OS細胞中TRAF6的表達下降；METTL3在OS中高表達，通過m6A修飾增強TRAF6的表達水平，從而促進OS細胞的轉移。Zhou等[37]的研究表明，METTL3通過m6A修飾提高了DANCR mRNA的穩定性，促進了OS的治療進展，說明METTL3可能是OS治療腫瘤的新靶點。Zhou等[38]通過沉默METTL3可使OS細胞增殖、遷移以及侵襲力下降，利用細胞學功能實驗證實了METTL3通過調節ATAD2在骨肉瘤生長和侵襲過程中發揮致癌基因的作用。Miao等[39]研究表明，m6A甲基轉移酶METTL3通過調控LEF1的m6A水平和激活Wnt/b-連環蛋白信號通路，從而促進骨肉瘤細胞的進展。可見，通過不同的RNA m6A甲基化轉移酶激活不同的上游基因、調控不同的下游靶基因，可影響骨肉瘤的發生發展進程，預示m6A修飾已成為OS發生發展過程中的一個不可或缺的因素。

3.2 m6A修飾在骨肉瘤化療耐藥中的作用

骨肉瘤目前的標準治療包括術前化療、術中病灶切除、術后化療，化學藥物治療有著不可替代的作用，但如今化療耐藥是臨床上骨肉瘤治療的一大瓶頸，因此，研究骨肉瘤化療耐藥的機制對骨肉瘤的治療有重要的意義。近期研究發現，骨肉瘤組織中TRIM7 m6A修飾缺失，METTL3和YTHDF2是參與TRIM7 m6A異常修飾的主要因素[40]，具有較高TRIM7水平的PDX小鼠和骨肉瘤細胞中易觀察到化療耐藥性，此研究預示m6A在化療耐藥中發揮重要作用，有望成為腫瘤耐藥治療的新靶點。臨床上常用的化療藥物阿霉素(DXR)，主要是通過誘導骨肉瘤干細胞激活Wnt/B-catenin信號通路來發揮作用[41]。Zhang等[42]研究發現，lncRNA FOXC2-AS1 m6A修飾及其反義轉錄本FOXC2在具有阿霉素耐藥性的骨肉瘤細胞和組織中均升高，同時FOXC2通過誘導耐藥相關的ABCB1基因來促進化療耐藥。以上研究結果表明，m6A與骨肉瘤的耐藥機制相關，可能通過提高或降低靶基因的m6A水平影響基因的表達及激活相關信號通路，從而影響腫瘤耐藥性，為降低臨床骨肉瘤化療耐藥提供理論依據。

3.3 m6A修飾在骨肉瘤靶向治療中的作用

m6A去甲基化酶主要包括FTO和ALKBH5。FTO和ALKBH5可通過影響底物m6A修飾水平激活多種信號通路以促進骨肉瘤進展，因此m6A相關蛋白的特異性抑制劑在骨肉瘤治療中發揮重要作用。Huang等[43]的研究團隊開發出兩種FTO抑制劑(FB23、FB23-2)，該抑制劑能選擇性地抑制人急性髓系白血病(AML)細胞中FTO的去甲基化功能，上調AML關鍵基因mRNA上的m6A修飾，并通過增加抑癌蛋白的豐度、降低促癌蛋白的豐度來抑制細胞增殖，從而實現抗AML腫瘤的治療效果，提示通過分子靶向性干預m6A修飾影響基因表達可能成為抗腫瘤的研究新方向。Shan等[44]通過檢測OS細胞/組織中KLF3的表達水平，發現OS細胞/組織中KLF3的mRNA水平和蛋白水平均升高，且與OS患者腫瘤TNM的分期及預后有關，同時FTO能促進OS細胞的增殖和侵襲，抑制細胞凋亡，FTO介導的KLF3 m6A修飾促進了OS進展，預示KLF3可能為OS提供治療靶點。Chen等[45]的研究表明，m6A去甲基化酶ALKBH5介導的PVT1上調，可促進體外OS細胞增殖和體內腫瘤生長，可知PVT1可能為OS提供治療靶點。

3.4 m6A修飾在骨肉瘤預后轉歸中的作用

目前，關于m6A修飾與OS預后的研究相對較少。不同的m6A修飾調控因子與OS預后的結果有所差別。Li等[46]通過公共基因組數據集和組織微陣列分析發現，METTL3、METTL14、YTHDF2的低表達以及KIAA1429、HNRNPA2B1的高表達與不良預后顯著相關，且HNRNPA2B1可能是OS的獨立危險因素。Zhang等[8]利用從有效治療方法的治療應用研究(TRAGET)中下載的數據集，通過生物信息學分析獲得與OS密切相關的m6A lncRNA，構建了m6A相關的lncRNA風險評分預后模型(RP11-286E11.1、LINC01426、AC010127.3、DLGAP1-AS2、RP4-657D16.3、AC002398.11)為OS預后研究提供了理論依據。Zhang等[47]通過分析骨肉瘤患者的預后信息發現，METTL3、YTHDC1、FTO是與生存率相關的重要標志物，且與骨肉瘤的轉移存在顯著相關性。Zheng等[48]利用生物信息學獲得骨肉瘤的保護因子AC004812.2，AC004812.2的低表達預示著總生存率較差，而AC004812.2的過表達可抑制143B細胞增殖，提高IGF2BP1和YTHDF1的表達水平，表明AC004812.2可能是m6A修飾的重要調控因子，也是骨肉瘤中很有前景的治療靶點。

WTAP在骨肉瘤組織中高表達，是骨肉瘤總生存期的獨立預后因素。有研究表明沉默的HMBOX1明顯減弱了shWTAP介導的對骨肉瘤生長和轉移的抑制，且WTAP/HMBOX1通過介導PI3K/AKT通路調控骨肉瘤的生長和轉移，證實了WTAP介導的m6A修飾在骨肉瘤進展中的關鍵作用，這可能為骨肉瘤的治療提供了新的見解[49]。另一項研究發現，YTHDF1表達水平低的患者預后較差，總生存率較低，提示YTHDF1可能與OS患者的預后不良有關[50]。隨著研究的深入，研究人員還發現了有利于OS患者預后的m6A修飾調控因子。FTO是m6A去甲基化酶，可以去除m6A修飾，調節mRNA的穩定性，最終導致各種癌癥發病機制的改變[51]。此外，也有研究表明，FTO是一種保護基因，FTO的高表達可以提高骨肉瘤患者的生存率，而IGF2BP2是骨肉瘤的風險基因，IGF2BP2的高表達降低了骨肉瘤患者的生存率，FTO和IGF2BP2的異常表達與骨肉瘤的進展顯著相關，是能夠獨立預測骨肉瘤患者預后的關鍵因素[52]。Liu等[53]通過檢測骨肉瘤組織中METTL14的表達量發現，METTL14與骨肉瘤患者的預后呈正相關，METTL14表達下調可能是骨肉瘤發生的一個潛在機制，可作為腫瘤抑制基因。

綜上可知，上述m6A修飾調控因子為OS的診斷、治療及預后轉歸的評估提供了新的思路，為進一步深入研究m6A修飾調控OS的發生和發展機制提供了研究方向，為OS的輔助治療提供了新的生物標志物。

4 展望

目前，m6A在OS中的機制研究正處于發展階段，盡管在m6A生物學領域取得了顯著的進展，但仍存在許多未知數和挑戰。m6A修飾就像一把“雙刃劍”，可以通過不同的方式加速或抑制骨肉瘤的進展[54]。本文總結了m6A修飾在骨肉瘤發生發展、化療耐藥、靶向治療、預后轉歸的分子機制方面的研究，以期為人類骨肉瘤的治療尋找有希望的靶點。雖然m6A的相關調節因子被證實可作為OS的診斷或治療靶點，但關于m6A的上游調控因子和下游靶點及其致癌或腫瘤抑制機制尚不清楚，仍有待進一步深入研究。因此，未來還需從以下3個方面進行突破：第一，立足OS構建m6A及其相關修飾因子的復雜調控網絡模型；第二，增大臨床入選樣本量和篩選因子，作為早期診斷和預后的靶標因子；第三，在OS動物模型中開展與m6A相關的靶向治療，為OS靶向治療提供新的思路。