牙齦成纖維細胞誘導分化神經(jīng)細胞的可行性

石俊 關振群 王訓霞 張為新

(1青島市海慈醫(yī)療集團青島市中醫(yī)醫(yī)院口腔科，山東 青島 266000；2南京醫(yī)科大學附屬蘇州科技城醫(yī)院口腔科)

神經(jīng)組織是構成神經(jīng)系統(tǒng)的重要成分，主要由神經(jīng)細胞及神經(jīng)膠質(zhì)細胞構成。神經(jīng)細胞可進行信息接收、整合，并進行信息傳導，但是神經(jīng)細胞在發(fā)生損傷后很難再生，導致神經(jīng)系統(tǒng)損傷后再次修復成為臨床研究的難題〔1〕。因此，尋找一種增殖能力強、安全、易采集，且可分化為神經(jīng)細胞的細胞非常關鍵，以實現(xiàn)臨床神經(jīng)修復治療〔2〕。有學者嘗試將胚胎干細胞及骨髓間充質(zhì)干細胞誘導為神經(jīng)細胞，但研究中發(fā)現(xiàn)，此類細胞誘導的神經(jīng)細胞在移植后極易出現(xiàn)多種并發(fā)癥，如畸胎瘤等，且樣本獲取難度大，對患者機體造成損傷明顯〔3〕。有學者指出，牙齦成纖維細胞具有很高的分化潛能，可進行多向分化，與胚胎干細胞及骨髓干細胞相比獲取途徑簡單〔4〕。本研究選取阻生齒拔除患者牙齦組織，對其進行培養(yǎng)誘導，通過觀察細胞形態(tài)、檢測神經(jīng)遞質(zhì)分析牙齦成纖維細胞誘導分化為神經(jīng)細胞的可行性。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取青島市海慈醫(yī)療集團青島市中醫(yī)醫(yī)院2018年5月至2019年12月收治的阻生齒拔除患者，取其周圍正常牙齦組織作為研究樣本，其中男6例，女4例，年齡19～32歲，平均(24.5±1.5)歲。納入標準：(1)入組患者均經(jīng)阻生齒拔除治療；(2)患者無口腔炎癥；(3)患者對于本次研究內(nèi)容知情并同意。排除標準：(1)患者曾患有嚴重的口腔疾病，如口腔腫瘤；(2)患者存在精神障礙或溝通障礙；(3)患者存在影響細胞結構的相關疾病。本研究已獲得醫(yī)院倫理委員會批準。

1.2方法

1.2.1原代培養(yǎng)牙齦成纖維細胞 對獲取組織進行原代培養(yǎng)，選擇組織貼壁法，低糖DMEM培養(yǎng)液，在培養(yǎng)液中加入15%胎牛血清，使用磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗所得組織，取含高濃度雙抗的低糖DMEM培養(yǎng)液，浸泡組織20 min，取組織置于培養(yǎng)皿中，將組織上的殘留血管、上皮組織去除，制成組織小塊，移入培養(yǎng)瓶中，置于37℃環(huán)境中，二氧化碳濃度為5%，4 h后輕翻培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)液每3 d進行1次更換，每次更換注意沒過組織，使用顯微鏡觀察是否存在細胞移出情況。

1.2.2傳代培養(yǎng)牙齦成纖維細胞 對培養(yǎng)瓶中細胞培養(yǎng)結果進行密切觀察，確定其長至80%融合時進行分解，分解取胰蛋白酶，濃度為0.25%，繼續(xù)進行傳代培養(yǎng)，比例為1∶3，對人牙齦成纖維細胞培養(yǎng)液進行收集，置于-20℃環(huán)境中存儲，并將其記為對照組。

1.2.3鑒定人牙齦成纖維細胞 制備人牙齦成纖維細胞爬片，選擇對數(shù)生長期第4代的細胞，使用濃度為0.25%的胰酶進行消化，制成細胞懸液接種于培養(yǎng)皿中，靜置30 min，加入完全培養(yǎng)液至培養(yǎng)皿中，劑量完全覆蓋玻片。將培養(yǎng)皿放置于培養(yǎng)箱中，待細胞長至60%時去除培養(yǎng)液，使用PBS進行3次沖洗，使用丙酮進行24 h固定。免疫細胞化學染色，將固定好的爬片使用PBS進行數(shù)次沖洗，按照免疫組化法檢測試劑盒進行操作，顯微鏡下觀察染色結果，并對染色結果進行拍照。

1.2.4牙齦成纖維細胞的誘導培養(yǎng) 誘導時選擇第4代對數(shù)生長期的細胞，取低糖DMEM培養(yǎng)液，加入15%的胎牛血清，將1 mmol/L的β-巰基乙醇(ME)及20 μmol/L維甲酸加入培養(yǎng)液中，使用濃度為2%的DMEM進行誘導，時間為12 d，每48 h進行1次換液，每次換液后在倒置顯微鏡下進行觀察，對神經(jīng)樣細胞培養(yǎng)液進行收集，置于-20℃冰箱中待檢，該組記為誘導組。

1.2.5鑒定神經(jīng)樣細胞 免疫熒光化學法鑒定：取誘導12 d的細胞制成爬片，使用丙酮進行24 h固定，使用PBS進行洗滌，2 min/次，洗滌3次，孵育切片后，依次加入一抗、二抗，孵育期間注意避光，完成染色后使用甘油封片，并在顯微鏡下進行染色觀察，拍片。免疫細胞化學法鑒定：在對人牙齦纖維細胞進行12 d誘導后，制備細胞爬片，方法與上文中一致，分別加入鼠抗人膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)單克隆抗體、鼠抗人vimentin單克隆抗體及鼠抗人人微管相關蛋白(MAP)-2單克隆抗體，進行免疫細胞化學染色，記錄染色結果。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗對神經(jīng)樣細胞分泌功能進行測定：對誘導后的神經(jīng)樣細胞培養(yǎng)液及人牙齦成纖維細胞培養(yǎng)液進行測定，離心處理對照組細胞培養(yǎng)液(人牙齦成纖維細胞)及誘導組(神經(jīng)樣細胞)培養(yǎng)液，進行20 min離心處理，轉速3 000 r/min，按要求加樣。取兩組待測樣品，分別設置12個樣本孔，對待測樣本進行稀釋處理，在樣本孔中加入酶標試劑，封板孵育，完成孵育后進行顯色處理，測定吸光度，計算每組吸光度數(shù)值平均值，整理數(shù)據(jù)，對神經(jīng)遞質(zhì)濃度含量進行計算。

1.3統(tǒng)計學方法 采用SPSS18.0軟件進行χ2檢驗、t檢驗。

2 結 果

2.1培養(yǎng)及鑒定人牙齦成纖維細胞

2.1.1人牙齦成纖維細胞原代培養(yǎng)結果分析 在進行原代培養(yǎng)5～7 d時可觀察到細胞爬出，細胞有突起，胞體呈紡錘形或梭形，存在明顯的細胞輪廓，核呈卵圓形，細胞體及細胞核均較大，有明顯核仁，著色淺。游離細胞數(shù)量隨時間延長逐漸增多，生長方向為同一方向，呈簇樣生長，見圖1。

2.1.2傳代培養(yǎng)人牙齦成纖維細胞 在確定培養(yǎng)瓶中細胞生長達到要求時進行傳代培養(yǎng)，傳代培養(yǎng)期間細胞生長良好，細胞器豐富，增殖旺盛，在培養(yǎng)2～3 d后進行傳代培養(yǎng)，見圖1。

圖1 原代及傳代培養(yǎng)人牙齦成纖維細胞

2.1.3免疫細胞化學染色鑒定人牙齦成纖維細胞 人牙齦成纖維細胞經(jīng)染色顯示為vimentin表達陽性，細胞核為被染為藍色，細胞胞質(zhì)被染為棕黃色。人牙齦成纖維細胞呈GFAP表達陰性，細胞核被染為藍色，而細胞胞質(zhì)未染色。人牙齦成纖維細胞呈MAP-2表達陰性，細胞核被染為藍色，細胞胞質(zhì)未被染色，見圖2。

A、B：vimentin陽性；C、D：GFAP陰性，細胞呈梭形；E、F：MAP-2陰性圖2 免疫細胞化學染色鑒定人牙齦成纖維細胞(×400)

2.2誘導人牙齦成纖維細胞分化為神經(jīng)細胞

2.2.1在誘導后第5天便可觀察到成纖維細胞胞體發(fā)生轉變，部分細胞由原來的梭形轉變?yōu)樾切位蛉切危毎稍镜?個突起增長為3個及以上，細胞核變圓，突起細長，出現(xiàn)軸突樣和樹突樣結構，且互相連接，呈現(xiàn)網(wǎng)狀結構，且隨誘導時間延長，其呈現(xiàn)神經(jīng)樣細胞改變越明顯，在誘導第12天，幾乎無梭形細胞存在，細胞形態(tài)均改變?yōu)樯窠?jīng)樣細胞形態(tài)，見圖3。

A、B：胞體呈三角形或多邊形，多突起，連成網(wǎng)；C、D：胞體呈三角形，細胞多突起；E、F：胞體呈多邊形，細胞突起尖細長；G、H：胞體呈多邊形，多突起圖3 成纖維細胞胞體形態(tài)逐漸成為神經(jīng)樣細胞形態(tài)(×400)

2.2.2對誘導產(chǎn)生的神經(jīng)樣細胞進行胰酶消化，還可對細胞繼續(xù)進行傳代培養(yǎng)，神經(jīng)樣細胞經(jīng)傳代培養(yǎng)后7 d會出現(xiàn)凋亡情況。

2.3鑒定神經(jīng)樣細胞

2.3.1采用免疫細胞化學法鑒定神經(jīng)樣細胞 經(jīng)染色顯示，神經(jīng)樣細胞為vimentin表達陽性，細胞核被染為藍色，胞質(zhì)染為棕黃色；經(jīng)染色顯示神經(jīng)樣細胞GFAP表達陽性，細胞核被染為藍色，胞質(zhì)被染為棕黃色；經(jīng)染色顯示神經(jīng)樣細胞MAP-2表達陽性，細胞核被染為藍色，胞質(zhì)被染為棕黃色，見圖4。

2.3.2采用免疫熒光化學法鑒定神經(jīng)樣細胞 經(jīng)染色顯示，神經(jīng)陽性細胞為GFAP表達陽性，且細胞核被染為藍色，胞質(zhì)為綠色熒光染色；經(jīng)染色顯示，神經(jīng)陽性細胞為MAP-2表達陽性，細胞核被染為藍色，胞質(zhì)為紅色熒光，見圖5。

圖5 免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)神經(jīng)樣細胞GFAP、MAP-2表達陽性(×200)

2.3.3酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測神經(jīng)細胞分泌的神經(jīng)遞質(zhì) 誘導組乙酰膽堿及多巴胺濃度〔(75.6±3.8)、(56.2±3.8)pg/ml)〕均明顯高于對照組〔(12.6±1.7)、(8.9±1.1)pg/ml；均P<0.05〕。

3 討 論

多種疾病可導致神經(jīng)損傷發(fā)生，而神經(jīng)細胞往往不可再生，因此尋找一種良好治療方案對于改善神經(jīng)損傷有著非常重要的意義。細胞移植可有效補充患者神經(jīng)細胞，改善患者預后，但是如何誘導可移植的神經(jīng)細胞一直以來都是臨床研究的難題〔5〕。干細胞由成體干細胞和胚胎干細胞組成，其功能不同又可分為多種干細胞，在皮膚、骨髓、神經(jīng)、脂肪等多種組織中均存在成體干細胞〔6〕。有研究指出，對牙髓細胞進行培養(yǎng)可分化為牙髓干細胞，隨技術不斷成熟，已在口腔牙齦的固有層中發(fā)現(xiàn)未分化的間充質(zhì)干細胞〔7〕。有研究指出，采用綠色熒光蛋白進行標記，將標記后的體外培養(yǎng)人牙齦間質(zhì)干細胞植入到牙周，發(fā)現(xiàn)其可有效修復牙周膜及牙骨質(zhì)〔8〕。成體干細胞具有多向分化潛能，可塑性很強，在達到一定條件時可與不同胚層及相同胚層起源的成體干細胞進行互相轉換〔9〕。有報道指出，牙齦成纖維細胞具有分化為血管內(nèi)皮細胞、軟骨細胞、骨細胞及骨骼肌細胞等潛能〔10〕。結合以往研究可以看出，牙齦成纖維細胞具有多向分化潛能，且在樣本取樣方面具有一定優(yōu)勢〔11〕。

神經(jīng)細胞在人體中發(fā)揮重要作用，主要負責信息傳導，從而構成了意識、思想、感覺及復雜運動等，但是在發(fā)生神經(jīng)損傷后其自愈能力差，增加其修復難度〔12〕。通過對人牙齦成纖維細胞進行誘導培養(yǎng)可分化為多種細胞類型。神經(jīng)細胞主要由軸突、樹突、胞體3部分組成，每個神經(jīng)細胞含有一個軸突，多個樹突。本研究發(fā)現(xiàn)，在完成誘導后形成的神經(jīng)樣細胞胞體由原來的梭形變?yōu)槿切位蚨噙呅危毎斐鐾黄穑彝黄鹬g相互連接形成網(wǎng)狀，其結構與神經(jīng)細胞的軸突、樹突樣結構一致。牙齦成纖維細胞表面存在特異性標志物，且呈現(xiàn)vimentin蛋白陽性，可看出在正常生理條件下的牙齦成纖維細胞中存在vimentin蛋白，而進行進一步分析時發(fā)現(xiàn)，牙齦成纖維細胞中不含神經(jīng)膠質(zhì)細胞特異性表面標志物GFAP及神經(jīng)元特異性表面標志物MAP-2，經(jīng)免疫組化法檢測顯示為陰性。進一步證實本研究所獲取的牙齦成纖維細胞為結締組織細胞，而并非神經(jīng)組織來源。在完成誘導后再次對誘導后的神經(jīng)樣細胞進行檢測，結果提示誘導后獲得的神經(jīng)樣細胞除呈現(xiàn)神經(jīng)細胞結構、形態(tài)外，還可進行神經(jīng)細胞相關標志物表達，但是其中仍保留有牙齦成纖維細胞的免疫特征。因細胞移植的關鍵在于細胞功能，在對其誘導后神經(jīng)樣細胞結構、形態(tài)及蛋白表達情況進行分析后，本研究對其細胞功能進行了進一步分析。有報道指出，帕金森綜合征、阿爾茨海默病等神經(jīng)元退變類疾病的發(fā)病與多巴胺能神經(jīng)元及膽堿能神經(jīng)元的變性有關〔13〕。有研究指出，可對胚胎干細胞進行誘導培養(yǎng)，使其分化為神經(jīng)細胞，并且誘導后的細胞可產(chǎn)生乙酰膽堿等神經(jīng)遞質(zhì)〔14〕。有學者提出，在去甲腎上腺素的交感神經(jīng)元中可同時存在去甲腎上腺素及乙酰膽堿〔15〕。近幾年，多種生物化學技術逐漸應用，越來越多的研究證實，在一個神經(jīng)元中可共存由兩種或以上幾種神經(jīng)遞質(zhì)。本研究結果說明，將牙齦成纖維細胞誘導分化成的神經(jīng)樣細胞不僅具有神經(jīng)細胞結構、形態(tài)，還同樣具有神經(jīng)細胞分泌功能，可分泌相關神經(jīng)遞質(zhì)，行駛神經(jīng)細胞的功能。本研究初步證實，可由牙齦成纖維細胞誘導分化成為神經(jīng)樣細胞，但是對于其是否滿足臨床移植需求還需進行進一步研究證實。

綜上，對牙齦成纖維細胞進行誘導處理可獲得神經(jīng)樣細胞，誘導后細胞不僅具有神經(jīng)細胞結構、形態(tài)，同樣具有神經(jīng)細胞的分泌功能，分泌大量的乙酰膽堿及多巴胺等神經(jīng)遞質(zhì)。