miR-34a對膀胱尿路上皮癌細胞Beclin1介導的自噬及吉西他濱化療敏感性的影響

楊濤 王剛 孫福振 李守賓 郭留雄 鄧新娜 劉俊江

(河北省人民醫院 1泌尿外科，河北 石家莊 050000；2腫瘤四科)

膀胱癌的病理類型主要包括膀胱尿路上皮癌、膀胱癌和膀胱鱗狀細胞癌。膀胱尿路上皮癌是膀胱癌最常見的病理類型，以前稱為膀胱移行細胞癌，占膀胱癌患者總數的90%以上〔1〕，其特點為發展迅速、復發率高，患者5年生存率僅為6%且預后極差〔2〕。微小RNA(miRNA)是一類長度為20～25 nt，具有基因調控功能的小分子非編碼RNA，其中，過表達miR-34a可提高胃癌對抗癌藥物的敏感性〔3〕。而過表達miR-34a還能夠抑制癌細胞生長，前人研究發現，降低miR-34a表達水平可以促進膀胱癌細胞的增殖〔4〕。自噬是一個吞噬自身細胞質蛋白或細胞器并使其包被進入囊泡，并與溶酶體融合形成自噬溶酶體，降解其所包裹的內容物的過程，在機體生理和病理過程中常見〔5〕，其發揮的正負面作用尚不完全清楚。但是，有研究發現，自噬是耐化療的重要機制，可幫助腫瘤細胞克服紫杉醇等化療藥物引起的代謝應激，保護腫瘤細胞存活并產生耐藥〔6〕。而腫瘤抑制因子可以通過抑制自噬，提高膀胱癌細胞對吉西他濱的化療敏感性〔7〕。但是，目前miR-34a對膀胱尿路上皮癌細胞J82中Beclin1介導的自噬及吉西他濱化療敏感性的影響尚未見報道。本研究通過使用前期構建的J82耐吉西他濱細胞株(J82/Gem)，并轉染miR-34a模擬物，研究過表達miR-34a對J82/Gem自噬及化療敏感性的影響。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細胞株和藥物 膀胱尿路上皮癌細胞株J82購自美國Sciencell公司；吉西他濱(規格：0.2 g×8瓶)購自江蘇豪森藥業集團有限公司。

1.1.2主要試劑及儀器 含10%胎牛血清(FBS)的DMEM/F12培養基購自美國Giboc公司；RNA提取試劑盒購自北京天根生化科技有限公司；細胞自噬染色檢測試劑盒〔單丹磺酰尸胺(MDC)染色法〕購自索萊寶生物科技有限公司；逆轉錄試劑盒購自美國Genecopoeia公司；miR-34a NC(miR-34a陰性對照)、miR-34a模擬物(miR-34a mimics)及miR-34a和U6引物均由上海生工生物工程有限公司合成；Lipofectamine2000轉染試劑盒購自美國Invitrogen公司；聚偏氟乙烯(PVDF)膜、十二烷基硫酸鈉(SDS)和β-actin鼠抗均購自美國Sigma公司；蛋白提取試劑盒、電化學發光(ECL)顯色試劑盒和二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒均購自北京中杉金橋生物科技有限公司；CCK-8細胞活性檢測試劑盒、Beclin1、微管相關蛋白輕鏈(LC)3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、p62鼠抗和辣根過氧化物酶標記羊抗鼠IgG二抗均購自美國Abcam公司；酶標儀Fax-20100購自美國INStat公司；尼康SMZ745光學顯微鏡購自上海普赫生物科技有限公司；FACSCanto流式細胞儀購自美國Beckman公司；TL988 qRT-PCR儀購自西安天隆科技有限公司；全能型凝膠成像分析系統ChemiDoc-MP購自山東三瑞科技有限公司；轉膜儀和電泳儀均購自美國Bio-Rad公司。

1.2細胞培養與分組 J82細胞使用含有10% FBS DMEM/F12培養基，在37℃含5% CO2的恒溫培養箱中培養。本研究前期通過吉西他濱誘導建立J82/Gem細胞系(J82耐吉西他濱細胞系)，為維持耐藥表型，用0.5 μg/ml的吉西他濱培養J82/Gem細胞。并將J82/Gem細胞分別轉染miR-34a NC(miR-34a NC組)和miR-34a mimics(miR-34a mimics組)，轉染24 h，另取未轉染J82/Gem細胞(J82/Gem組)和J82細胞(J82組)，均使用含0.5 μg/ml的吉西他濱培養24 h后，檢測其增殖、凋亡和自噬。

1.3qRT-PCR檢測各組細胞中miR-34a表達水平 采用RNA抽提試劑盒提取各組細胞總RNA，反轉錄得到cDNA置于-20℃冰箱保存待用。采用qRT-PCR法擴增miR-34a目的片段。反應體系和反應條件參照qRT-PCR試劑盒說明書。以U6為內參，采用2-ΔΔCt計算細胞中miR-34a相對表達水平。miR-34a及其內參U6引物序列：miR-34a：上游5′-CAACAGAAGGCTCGAGCCTCCTGCATCCTTTCTTTC-3′、下游5′-ATTCTGATCAGGATCCTGGAGCTCACTTTC-CCAG-3′；U6:上游5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′、下游5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。

1.4CCK-8法檢測各組細胞增殖活性及吉西他濱敏感性 收集培養24 h后的各組細胞，每孔100 μl接種至96孔板中，加入濃度為10%的CCK-8溶液，繼續培養2 h后，于酶標儀上測定各孔在450 nm波長下的OD值，OD值越大表明其增殖活性越高。

取對數生長期的各組細胞，調整細胞濃度為5×104個/ml，每孔100 μl接種至96孔板中，置于37℃，含5% CO2的細胞培養箱中培養4～6 h至細胞貼壁生長，分別加入終濃度為0.1，0.5，1.0，5.0，10.0，20.0 μg/ml的吉西他濱處理24 h后，檢測細胞增殖活性，然后根據劑量-反應曲線計算吉西他濱的半數抑制濃度(IC50)。

1.5流式細胞儀檢測各組細胞凋亡率 收集培養24 h后的各組細胞，1 200 r/min離心5 min，棄培養基，用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌2次，加入400 μl結合緩沖液懸浮細胞，再加入5 μl膜聯蛋白(Annexin)V染液，輕輕混勻后于2～8℃避光條件下孵育15 min；然后加入10 μl碘化丙啶(PI)輕輕混勻，于2～8℃避光繼續孵育5 min后，上流式細胞儀檢測各組細胞凋亡率。

1.6MDC染色觀察各組細胞自噬小體 收集培養24 h后的各組細胞，使用PBS洗滌2遍，取1 ml PBS重懸細胞，加入1 μl濃度為50 mmol/L的MDC工作液，使MDC終濃度為0.05 mmol/L，37℃避光孵育30 min后，PBS再次洗滌3遍，吸取微量少量細胞懸液與載玻片上，蓋上蓋玻片，使用熒光顯微鏡觀察各組細胞自噬小體，并計算MDC陽性細胞率。

1.7Western印跡檢測各組細胞中自噬相關蛋白表達水平 收集培養24 h后的各組細胞，使用蛋白提取試劑盒提取總蛋白。使用BCA蛋白定量試劑盒對蛋白進行定量，然后依次進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)、轉PVDF膜、5%脫脂奶粉封閉、1∶2 000濃度稀釋后的Beclin1、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、p62、β-actin鼠抗4℃過夜孵育、含辣根過氧化物酶綴合的二抗(1∶5 000)中室溫孵育2 h，用ECL顯色試劑盒顯色，以β-actin內參，全能型凝膠成像分析系統分析蛋白表達水平。

1.8統計學分析 采用SPSS22.0軟件進行方差分析，進一步兩兩比較采用SNK-q檢驗。

2 結 果

2.1過表達miR-34a對J82/Gem細胞增殖活性及吉西他濱IC50值的影響 與J82組相比，J82/Gem組和miR-34a NC組細胞miR-34a表達水平降低，增殖活性和吉西他濱IC50值升高，差異均有統計學意義(均P<0.05)；與miR-34a NC組相比，miR-34a mimics組細胞miR-34a表達水平升高，增殖活性和吉西他濱IC50值降低，差異均有統計學意義(均P<0.05)。見表1。

表1 各組細胞miR-34a表達水平、增殖活性及吉西他濱IC50值比較

2.2過表達miR-34a對J82/Gem細胞凋亡率影響 與J82組〔(72.33±7.48)%〕相比，J82/Gem組和miR-34a NC組細胞凋亡率降低，差異具有統計學意義〔(14.58±1.83)%、(12.27±1.45)%，P<0.05〕；與miR-34a NC組相比，miR-34a mimics組細胞凋亡率升高，差異具有統計學意義〔(76.08±7.96)%,P<0.05〕。見圖1。

圖1 各組細胞凋亡

2.3過表達miR-34a對J82/Gem細胞自噬率的影響 與J82組〔(19.23±2.14)%〕相比，J82/Gem組和miR-34a NC組細胞自噬率升高，差異具有統計學意義〔(56.37±5.89)%、(58.65±5.90)%，P<0.05〕；與miR-34a NC組相比，miR-34a mimics組細胞自噬率降低，差異具有統計學意義〔(16.24±5.90)%,P<0.05〕。見圖2。

箭頭所示為MDC染色陽性細胞圖2 各組細胞自噬小體熒光顯微鏡觀察(×400)

2.4過表達miR-34a對各組細胞自噬相關蛋白表達水平的影響 與J82組相比，J82/Gem組和miR-34a NC組細胞Beclin1、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ蛋白表達水平升高，p62蛋白表達水平降低，差異均具有統計學意義(均P<0.05)；與miR-34a NC組相比，miR-34a mimics組細胞Beclin1、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ蛋白表達水平降低，p62蛋白表達水平升高，差異均具有統計學意義(均P<0.05)。見表2、圖3。

表2 各組細胞中Beclin1、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ和P62蛋白表達水平比較

圖3 Western印跡檢測各組細胞自噬相關蛋白表達

3 討 論

膀胱尿路上皮癌是我國發病率最高的泌尿系統腫瘤，其生物學行為復雜，進展快，易復發，化療是常規手術后治療局部疾病的有效方法，然而患者易對化療藥物產生抵抗，是臨床治療失敗的主要原因〔8〕。吉西他濱是臨床上聯合順鉑化療膀胱癌的主要藥物，癌細胞對吉西他濱耐受性的出現，嚴重影響其治療效果〔9〕，所以，提高膀胱尿路上皮癌細胞對吉西他濱的敏感性是當下研究的熱點。本研究結果提示，J82對吉西他濱化療敏感性的作用機制與miR-34a密切相關，但尚需進一步研究。

自噬是一個嚴格調控的分解代謝過程，抑制自噬可能使腫瘤細胞對常見藥物敏感，或克服這些細胞對化療藥物的耐藥性〔10〕。Zeng等〔11〕研究發現抑制自噬使可膀胱尿路上皮細胞癌對紫杉醇敏感，Sun等〔12〕研究發現抑制自噬可增強非小細胞肺癌的化療敏感性。但是，關于自噬與細胞及疾病關系一直是爭論的焦點，細胞自噬是把雙刃劍，細胞既可通過提高自噬減少細胞壞死，減輕有毒物質的積累，又可通過主動降低自身自噬活性，減少因自噬引起的細胞死亡〔13〕。而自噬蛋白Beclin1、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ表達水平可反映自噬程度，自噬溶酶體降解底物p62表達的增加與自噬水平呈反相關〔14〕。本研究結果表明，J82/Gem細胞中自噬水平較高，提示抑制J82/Gem細胞中自噬可能提高其化療敏感性。

miR-34a不但參與癌癥發病機制的多種細胞和分子途徑，在腫瘤發生和化療耐藥中發揮重要作用〔15〕，而且還在癌癥干細胞參與的人尿路上皮性膀胱癌耐藥和復發過程中發揮關鍵作用〔16〕。Zhang等〔17〕研究發現miR-34a在體內外均可增加結直腸癌細胞對5-氟尿嘧啶的敏感性。Li等〔18〕研究發現miR-34a通過上調相關信號通路信號，提高體外骨肉瘤細胞對順鉑的敏感性。Liu等〔19〕研究發現miR-34a通過靶向HMGB1基因，在急性髓系白血病細胞中促進細胞凋亡和抑制自噬。本研究結果表明，過表達miR-34a可抑制J82/Gem細胞自噬及自噬相關蛋白表達，提高J82/Gem細胞對吉西他濱的敏感性。有研究指出，miR-34a可通過抑制自噬，降低結腸癌細胞對奧沙利鉑的耐藥性〔20〕。提示miR-34a可能通過抑制自噬，提高J82/Gem細胞對吉西他濱的敏感性。

綜上，miR-34a可能通過抑制Beclin1介導的自噬，提高膀胱尿路上皮癌細胞對吉西他濱的化療敏感性，但其中的機制較為復雜，尚需深入研究。